202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
11 HU 2Ü2279 B 12 Miután azokat a vektorokat, amelyek az izopenicillin N-szintetázt kódolják, azonosítottuk, egy adott izopenicillin N-szintetázt kódoló vektort módosítunk olyan módon, hogy kiiktatjuk a vektoron jelen levő Cephalosporium acremonium DNS legtöbbjét, azokat, amelyek nem kódolnak izopenicillin N-szintetáz enzimet. Az így létrejött vektort, amelyet pIT335 plazmidnak nevezünk el, E. coli K 12 JA221 gazdasejtekbe transzformáljuk. Az igy létrejött E. coli K 12 JA221/pIT335 transzfermánsokat deponáltuk, igy ezek részévé váltak a Northern Regional Research Laboratories (Peoria, Illinois) törzstenyészet-gyüjteményének, NRRL B-15960 letéti számon. A PÍT335 restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül az 1. ábrában mutatjuk be. A pIT335 plazmidot E. coli K 12 JA221- -ből izolálhatjuk, az 1. példában leírt eljárással. A pIT335 plazmidot használjuk kiindulási anyagként a pIT337-nek nevezett plazmid megalkotásában, amely plazmid ösztönzi az izopenicillin N-szintetáz magasszintű kifejeződését E. coliban. A pIT337 plazmidot úgy alkotjuk meg, hogy a pIT335 plazmid ~ 1,5 kb-s Ncol-BanMl restrikciós fragmensét ligáljuk a pCZ106 plazmid ~ 8,7 kb-s Ncol-Ncol és - 1,6 kb-s Ncol-BamHl restrikciós fragmenseihez. A pCZ106 plazmid tartalmaz egy .elszabadult" replikont, a trp átíró és transzlációs aktiváló szekvenciát és operátort, és egy szarvasmarha növekedési hormon származékát kódoló DNS szekvenciát. A pCZ106 plazmidon levő .elszabadult" replikon típus alkalmazását a 4 487 835, 4 499 189 és 4 495 787 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban írják le, ez a plazmid ezekbe bele van foglalva. Alacsony hőmérsékleten, kb. 25 °C-on .elszabadult" replikont tartalmazó plazmid ~ 10-15 kópiaszámmal rendelkezik E. coli gazdasejtben, de amikor a hőmérséklet kb. 37 °C-ra emelkedik, a kópiaszám mintegy 1000 kópia/E. coli gazdasejtre emelkedik. E. coli K 12 RV308/pCZ106 gazdasejtek, amelyekből a pCZ106 plazmidot lehet izolálni, letétbe vannak helyezve és a Northern, Regional Research Laboratories (Peoria, Illinois) törzstenyészet gyűjteményének részét képezik, NRRL B-15959 letéti szám alatt. A pCZ106 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 2. ábra mutatja be. A pIT337 plazmid magában foglalja a pCZ106 plazmid .elszabadult" replikonját és trp átíró- és transzlációs aktiváló szekvenciáját, valamint a pIT335 plazmid ból az izopenicillin N~6zintetéz fehérje-kódoló szekvenciát. A pIT335 plazmid ~ 1,5 kb-s WcoI-BamHI restrikciós fragmense magában foglalja az izopenicillin N-szintetázhoz való teljes fehérje-kódoló szekvenciát, és az Ncől restrikciós enzim felismerő szekvenciát, amely 5’-CCATGG-3' min 3’-GGTACC-5’ és tartalmazza az 5’-ATG-3’ III 3-TAC-5’ szekvenciát, amely az izopenicillin N-szintetáz amino-terminális metionil-gyökét kódolja. A pIT337 plazmid olyan módon van megalkotva, hogy a trp átíró és transzlációs aktiváló szekvencia úgy helyezkedjen el, hogy elősegítse az izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS kifejeződését. A pIT337 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 3. ábra mutatja be. A 2. példa írja le részletesebben a pIT337 plazmid megalkotását. 37 °C hőmérsékleten az E. coli K 12 RV308 (NRRL B-15624) sejtjei, amelyek pIT337 plazmidot foglalnak magukban, magas szinten fejeznek ki izopenicillin N-szintetázt, amely megközelíti a teljes sejtfehérje mintegy 9%-át. Az ezekből az E. coli K 12 RV308/pIT337 transzformánsokból nyert nyers sejtextraktumok képesek katalizálni 6-(L-oC-amino-adipil)-L-ciszteinil-D-valin átalakulását izopenicillin N-né, mig a nem transzformált E. Coli K 12 RV 308 sejtekből nyert sejt-extraktumok nem képesek katalizálni ezt az átalakulást. Az átalakulási reakcióhoz tartozó vizsgálat módszereit és a vizsgálat eredményeit a 3. példában adjuk meg. A pIT337 plazmid hatékony módszert nyújt nagy mennyiségű izopenicillin N-szintetáz termelésére E. coli-ban. Mivel a pIT337 plazmid E. coli transzformánsai az összes sejtfehérje 9%-át megközelítő szinten fejeznek ki izopenicillin N-szintetázt, és mivel az E. coli tenyésztése kevésbé komplex feladat, mint azoké az organizmusoké, amelyek természetes úton termelnek izopenicillin N-szintetázt, az E. coli/pIT337 transzformánsokat használhatjuk, hogy rekombináns izopenicillin N-szintetázt termeljünk sokkal hatékonyabban és gazdaságosabban, mint a nem-rekombináns vagy .természetes" izopenicillin N-szintetáz termelők. Az izopenicillin N-szintetázt arra használhatjuk, hogy izopenicillin N-t termeljünk ó- (L-cC-amino-adipil)-L-ciszteinil-D-valinból sejtmentes rendszerben, amint ezt a 3. példában leírjuk. Az izopenicillin N nem csupán hasznos antibiotikum, hanem kiindulási anyag is olyan fontos antibiotikumokhoz, mint a penicillin N, cefalexin, és más cefalosporinok (láBd a 4 307 192 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Az izopenicillin N-szintetáznak talán legfontosabb alkalmazási területe az enzim alkalmazása ó-(L-oC-amino-adipil)-L-ciszteinil-D-valintól eltérő tripeptidek kondenzálása új 0-laktám származékká. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
