202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
47 HU 202279 B 48 pPS22 és pPS24 plazmidokat szintén alkalmazzuk C. acremonium transzformálására, de ezek a plazmidok a C. acremoniumot higromicin rezisztenciára sokkal kisebb gyakorisággal transzformálják, mint ahogyan ezt a pPS21A, pPS25.1 és pPS25 plazmidok teszik, valószínűleg azért, mert a pPS22 és pPS24 plazmidoknak a C. acremonium-genomba a megfelelő helyzetben kell integrálódniok genoraos C. acremonium aktiváló szekvenciaként, hogy a higromicin rezisztencia-átadó gén kifejezését elörevigyék. 8. példa A pPS28 és pPS29 plazmidok megalkotása A pPS21A plazmid DNS 20 pl-ét feloldjuk 10 pl 10 x Pstl reakciópufferban (1,0 mól/liter NaCl; 100 mmól/liter trisz-HCl, pH = 7,5; 100 mmól/liter MgCte; és 1 mg/ml BSA) és 88 aj 1 HíO-ban. Mintegy 2 pl (150 egység) Pstl restrikciós enzimet a DNS oldathoz adjuk, és a reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten 4 percen át inkubáljuk, majd a reakciókeveréket 70 °C hőmérsékleten, 10 percen át végzett inkubálással állítjuk le. A részlegesen Psfl-el emésztett pPS21A plazmid DNS-t agaróz-gélre terheljük, és elektroforézis, valamint a gél megfestése után a következő fragmenseket figyeljük meg: 8,5 kb (linearizált plazmid); 8,0 kb; 7,5 kb; 7,0 kb; 6,6 kb; 6,1 kb; 5,2 kb; 3,3 kb; 2,3 kb; 1,9 kb; 1,5 kb; 1,0 kb; és 0,5 kb. A - 6,6 kb-s és 6,1 kb-s Pstl restrikciós fragmenseket egyedileg izoláljuk, lényegében a 2B. példa eljárásával összhangban; mintegy 0,5 pg-ot nyerünk ki mindkét fragmensből. A - 6,6 kb-s Pstl restrikciós fragmenst feloldjuk 3 pl 10 x ligáz pufferban és 25 pl HzO-ban. Mintegy 2 pl T4 DNS ligázt adunk a DNS-oldathoz, és az igy létrejött reakciókeveréket egy éjszakán át inkubáljuk 15 °C hőmérsékleten. A ligáit DNS alkotja a kivánt pPS28 plazmid DNS-t, amelyet E. coli K12 C600 transzformálására használunk, lényegében a 7. példa eljárásával összhangban. Hasonló módon, a - 6,1 kb-s Pstl restrikciós fragmenst kór alakúvá tesszük ligálással, a pPS29 plazmidot termelve, amelyet szintén E. coli K12 C600 plazmidba transzformálunk. A pPS28 és pPS29 plazmidok restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 10. illetve 11. ábrák mutatják be. A pPS28 és pPS29 plazmidokat alkalmazzuk Cephalosporium acremonium transzformálására, lényegében a 6. példa eljárásával összhangban. A C. acremonium/pPS28 és C. acremonium pPS29 transzformánsok higromicin-rezisztens fenotipust mutatnak, és a pPS28 és pPS29 plazmid a C. acremoniumot nagy gyakorisággal transzformálja higromicin-rezisztenciára. 9. példa A pPS26 és pPS26.1 plazmidok megalkotása Mintegy 20 pg pPS21A plazmidot oldunk fel 10 pl 10 x HindHI reakciópufferban és 85 pl vizben. Mintegy 5 pl (50 egység) HindllI restrikciós enzimet adunk a DNS oldathoz, és az így létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át. A HindIII-al emésztett pPS21A DNS plazmidot 1%-os agaróz gélre terheljük, és elektroforézisnek vetjük alá, amig a - 3,45 kb-s, ~ 3,16 kb-s, - 1,2 kb-s és - 0,69 kb-s Hindlll restrikciós fragmensek tisztán elkülönülnek a gélen. A ~ 3,45 kb-s Hindlll restrikciós fragmenseket lényegében a 2B. példa szerinti eljárással összhangban izoláljuk. Mintegy 5 ug kivánt ~ 3,45 kb-s Hindlll restrikciós fragmenst nyerünk, ezt 10 pl HíO-ban szuszpendáljuk. A pPS21A plazmid - 3,45 kb-s Hindlll restrikciós fragmenséból mintegy 2 pl-t adunk 1 pl, HindIII-al emésztett pIT335 plazroidhoz (amelyet a 4A példában állítottunk elő), 3 pl 10 x ligáz pufferhez, 22 pl HíO-hoz és 2 pl T4 DNS ligázhoz. Az így létrejött ligációs reakciókeveréket 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakén át. A ligáit DNS alkotja a kívánt pPS26 és pPS26.1 plazmidokat. A ligáit DNS-t alkalmazzuk E. coli K12 C600 transzformálására, lényegében a 7. példa eljárásával összhangban. Az E. coli K12 C600/pPS26 és E. coli K12 C600/pPS26.1 transzformánsokat ampicillin-rezisztens fenotípusok és plazmid DNS-ük restrikciós-elemzése alapján azonosítjuk. A pPS26 plalzmid restrikciós hely- és műveleti térképét a mellékelt ábrák közül a 12. ábra adja meg. A pPS26 és pPS26.1 plazmidokat használjuk Cephalosporium acremonium transzformálására, lényegében a 6. példa eljárásával összhangban. A pPS26 és pPS26.1 plazmidok nagy gyakorisággal transzformálják a C. acremoniumot higromicin-rezisztenicára, és a C. acremonium/pPS26 és C. acremonium/pPS26.1 transzformánsok jelentősen több izopeniciilin N-L termelnek - a Micrococcus luteus növekedés gátlási zónái alapján mérve - mint a nem transzformált társaik. 10. példa A pPS30, pPS30.1, pPS31 és pPS31.1 plazmidok megalkotása A. A pPS6 plazmid ~ 3,7 kb-s Xmal restrikciós fragmensének izolálása A pPS6 plazmid a 4 762 786 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban szerepel, a 13. példában, a 72-75. oldalon, ez az irodalmi hivatkozásként van beépítve a jelen bejelentésbe. Mintegy 10 pg 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 26
