202278. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fokozott stabilitású, rekombináns gamma-interferonok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
3 HU 202278 B 4 -LEU-PHE-LEU-GLY-ILE-LEU-LYS-ASN-TRP- 28 29 30 31 32 33 34 35 36-LYS-GLU-GLU-SER-ASP-ARG-LYS-ILE-MET- 37 38 39 40 41 42 43 44 45 -GLN-SER-GLN-ILE-VAL-SER-PHE-TYR-PHE- 46 47 48 49 50 51 52 53 54-LYS-LEU-PHE-LYS-ASN-PHE-LYS-ASP-ASP- 55 56 57 58 59 60 61 62 63-GLN-SER-ILE-GLN-LYS-SER-VAL-GLU-THR- 64 65 66 67 68 69 70 71 72-ILE-LYS-GLU-ASP-MET-ASN-VAL-LYS-PHE- 73 74 75 76 77 78 79 80 81-PHE-ASN-SER-ASN-LYS-LYS-LYS-ARG-ASP- 82 83 84 85 86 87 88 89 90-ASP-PHE-GLU-LYS-LEU-THR-ASN-TYR-SER- 91 92 93 94 95 96 97 98 99-VAL-THR-ASP-LEU-ASN-VAL-GLN-ARG-LYS- 100 101 102 103 104 105 106 107 108 -ALA-ILE-HIS-GLU-LEU-ILE-GLN-VAL-MET- 109 110 111 112 113 114 115 116 117-ALA-GLU-LEU-SER-PRO-ALA-ALA-LYS-THR 118 119 120 121 122 123 124 125 126-GLY-LYS-ARG-LYS-ARG-SER-GLN-MET-LEU- 127 128 129 130 131 132 133 134 135 -PHE-ARG-GLY-ARG-ARG-ALA-SER-GLN 136 137 138 139 140 141 142 143 ahol X jelentése metionin-maradék vagy hidrogénatom és Y jelentése glutamin-maradék, vagy ha X jelentése hidrogénatom, akkor vagy glutamin- vagy piroglutamát-maradék. A fenti aminosav-szekvenciájú gamma-interferonok azokat az analógokat is tartalmazzák, amelyekből hiányoznak a karboxil-végcsoportú megfelelő részek. A találmány a megfelelő klónozott génekre, az azokat tartalmazó kifejező vektorokra és azokra a transzformált termékekre is kiterjed, amelyek felhasználhatók a találmány szerinti interferonok DNS-rekombinációval történő előállitásához. A találmány szerinti előnyös rekombináns gamma-interferonok (összehasonlítva a szakirodalomban korábban jellemzettekkel) közelitik meg a legjobban a természetes eredetű gamma-interferon igazi aminosav-szekvenciáját. A természetes eredetű gamma-interferont természetes forrásokból különítettük el és teljes mértékben azonosítottuk. A találmány szerinti előnyös gamma-interferonok stabilitása és aktivitása lényegesen kedvezőbb a szakirodalomban korábban leírtakénál. A találmányt a következők során részletesen ismertetjük, felhasználva ehhez az ábrákat is. Az 1. ábra egy találmány szerinti rekombináns gamma-interferon 1-143 arainosavját mutatja be, továbbá az egy jel szekvenciával összekapcsolt aminosav-szekvenciát kódoló DNS-szekvenciát, amely utóbbi az 5’- és 3’- leforditatlan DNS-tartományokat is tartalmazza. A 2. ábra vázlatosan ismertet egy olyan plazmidot, amely egy találmány szerinti rekombináns gamma-interferon Escherichia coli törzsben történő közvetlen szintézisét kódolja. Az ábráról a plazmid előállítása is leolvasható. A 3. ábrán a találmány szerint előállított gamma-interferon fokozott stabilitását bizonyító adatok láthatók. Ismeretes, hogy a természetben megtalálható, emberi eredetű gamma-interferon (azaz amely az emberi vérben lévő limfociták mitogén indukálásával, majd tisztítással nyerhető) olyan polipeptid, amelyből hiányzik a Gray és munkatársai által a rekombináns gamma-interferonnak tulajdonított CYS-TYR-CYS- N-végcsoport; ez utóbbi interferon szekvenciáját Gray és munkatársai a fentebb idézett közleményükben ismertették. A nagy mértékben tisztított, természetben megtalálható gamma-interferon tripszines emésztése esetén olyan szekvenciákat kaptunk, amelyek aminosav-összetétele lényegében megfelelt a Gray és munkatársai által leirt rekombináns gamma-interferon N-terminális részének, nem tartalmazta azonban a CYS-TYR-CYS szekvenciát. A természetben megtalálható (natív) gamma-interferon N-végcsoportjától végzett aminosavszekvencia-analizis eredménytelennek bizonyult, és ebből azt a következtetést lehetett levonni, hogy a molekula N-végcsoportjánál lévő alfa-aminosav védócsoporttal volt ellátva. Mivel a Gray és munkatársai által megadott második cisztein után elhelyezkedő első aminosav, amelyet a komplementer DNS (cDNS) kódolt, GLN (glutamin) volt, úgy véltük, hogy a GLN-maradék ciklizálása inkább piroglutamátot eredményezett, így az N-végcsoport blokkolva volt. Amikor a piroglutamátot eltávolítottuk piroglutamát-aminopeptidáz enzim segítségével, a következő kódolt aminosav, az ASP szabad alfa-aminocsoportja maradt vissza, és végrehajthatóvá vált a szekvencia analízise. Ilyen módon először tudtuk jellemezni a természetben megtalálható, emberi eredetű gamma-interferont. A CYS-TYR-CYS- szekvenciát tartalmazó, emberi eredetű rekombináns gamma-interferonra vonatkozó komplementer DNS megfelelő módosítása lehetővé tette egy új rekombináns gamma-interferon Escherichia coli törzsben történő közvetlen kifejezését egy olyan komplementer DNS (cDNS) felhasználásával, amely ezt a fehérjét kódolta. E fehérje teljes szekvenciája a fentebb ismertetett, X jelen-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
