202277. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS-szekvenciák és ezeket a szekvenciákat tartalmazó plazmidok előállítására és felhasználásuk interferon szintéziséhez
17 HU 202277 B 18 egység Eco Rl-el utóemésztést végzünk. Ezt azért elónyós elvégezni, hogy a ligáz reakciónál keletkezett multimereket (ugyanis a kívánt reakció mellett mind az Eco Rí végek, mind a Hindui végek egymással összekapcsolódhatnak) újból monomerekké alakítsuk. Ezután a mintaanyagot 6%-os poliakrilamid gélben elválasztjuk é6 körülbelül 100 bp hosszú promoter/operátor-RBS-fragmentumot (amely egy Eco Rí .és egy HindlII véggel rendelkezik) a gélből kivágjuk, majd elektroforézissel eluáljuk, hogy a nem kapcsolódott RBS feleslegtől elválasszuk. Ezzel az expressziós plazmid kifejeződésért felelős részét előállítottuk (lásd a 3. ábrát). A 3. ábrában bemutatott nukleotid szekvencia a szakirodalomból ismert polinukleotid szintézisre vonatkozó módszerek alapján megszerkeszthető. d) A promoter/operátor-RBS fragmentum beépítése a pBR 322 plazmidba A pBR 322 plazmid 2 pg-ját Eco Rí és HindlII restrikciós enzimmel hasítjuk, miáltal két fragmentum keletkezik: egy 4332 bp hosszú nagy és egy 29 bp hosszú kis fragmentum. A nagy fragmentumot 0,8%-ob agaróz gél elektroforézissel választjuk el a kis fragmentumtól, a gélből kivágjuk és eluáljuk. E fragmentumnak mintegy 0,4 pmól-ját ligáz segítségével körülbelül 10 pmól promoter/operátor-RBS fragmentummal kapcsoljuk őszsze (lásd áz A fejezetet). A pBR 322 fragmentumok nem tudnak egymással kapcsolódni, mivel két túlnyúló végük nem illik össze; minthogy a promoter/operátor-RBS fragmentum a plazmidban csak egy irányban kapcsolható be, a HindlII hasitési hely irányában - a pBR 322 tetraciklin-rezisztencia génje felé - fokozó hatás lép fel. e) Escherichia coli transzformálása a pER 103 expressziós plazmiddal Escherichia coli HB 101 sejteket (NRRL B-11371) transzformálunk ez utóbbi ligáz reakcióban előállított szerkezettel a szakirodalomból ismert módon [Dworkin és Dawid, Dev. Bioi., 76, 435-448 (1980)] és transzformált sejteket ampicillin tartalmú agar lemezeken szelektáljuk. Az E. coli HB 101 sejteket 2x10® sejt/ml sűrűségig tenyésztjük, ülepítjük és 100 mmólos kalcium-klorid oldatban szuszpendáljuk (20 percig 0 °C-on). Ezután a sejteket a ligáz-reakció reakciókeverékével 5 percig 0-4 °C-on, majd 5 percig 37 °C-on inkubáljuk. A keverékhez ezután 0,5-1 ml L-Broth táptalajt adunk és további 15-30 percig inkubálunk 37 °C-on. Kiválasztottunk 19 transzformált sejtet és ezeket Hae III restrikciós enzimes emésztés segítségével megvizsgáltunk, hogy tartalmazzák-e a promoter/operátor-RBS fragmentumot. A 192 bp hosszú pBR 322/Hae III fragmentum hiányzott, melyet egy 264 bp hosszú fragmentum helyettesített (16 bp a Hae III hasítási helyről, amely a pBR 322-ben az Eco Rí hasítási helyétől .balra" esik + 103 bp promoter/operátor-RBS fragmentum + 145 bp a HindlII hasítási helyről, amely a pBR 322-ben a következő HindlII hasitási helytől .jobbra* esik). A 19 kiválasztott transzformált sejt közül 18 mutatta a várt emésztési képet (lásd a 2. ábrát). f) A pER103 expressziós plazmid promoter/operátor-RBS szakaszának szekvencia analízise Hogy a megszerkesztett expressziós plazmid helyességét kétséget kizáróan megállapítsuk, elvégeztük egy ilyen plazmid (pER 103) promoter/operátor-RBS szakaszának szekvencia analízisét és meghatároztuk helyzetét a pBR 322-ben. A szekvencia analízist a szakirodalomból ismert módszerrel, Maxam és Gilbert szerint [Proc. Natl. Acad. Sei. 74, 560-564 (1977)] végeztük el, mégpedig az Eco Rí hasitási helytől kiindulva a HindlII hasitási hely felé (és ezen túl), valamint a HindlII hasítási helytől kiindulva az Eco Rí hasitási hely felé (és ezen túl). Az eredmény a 3. ábrán bemutatott nukleotid szekvencia volt. A pER 103 tehát egy olyan expressziós plazmid, amely a Serratia marcescens triptofán operonjának promoter/operátor szakaszát egy szintetikus RBS-el kombinációban tartalmazza. Ez az új expressziós plazmid elősegíti azoknak a géneknek a transzkripcióját, amelyek be vannak építve ennek HindlII hasitási helyére és lehetővé teszi ezen transzkripciós termékeknek a hatékony transzlációját. Hogy ez valóban igy van, ezt a 2. példában mutatjuk be. 2. példa A pER 33 interferon termelő plazmid szerkesztése a) Az érett interferont meghatározó gén szerkesztése, az aminoterminális ciszteinért felelős kodon kihagyásával Az 1 F7 Pst I inszertumából 1 ug-ot emésztünk Sau 3A restrikciós enzimmel és a 177 bp hosszú fragmentumot, amely az aminoterminális cisztein kodon utáni Sau 3A hasitási helytől a következő Sau 3A hasitási helyig terjed és egy Ava II hasítási helyet foglal magába, 6%-os poliakrilamid gélből izoláljuk. A fragmentumot 1 egység alkalikus foszfatázzal kezeljük (lásd az A fejezetet), majd a foszfatáz fenolos és éteres extrakcióval történő eltávolítása után etanollal kicsapjuk. Ezután a fragmentumot Ava II-vel hasit-11 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
