202277. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS-szekvenciák és ezeket a szekvenciákat tartalmazó plazmidok előállítására és felhasználásuk interferon szintéziséhez
5 HU 202277 B 6 6mer 5* TCCTTA lOmer 5’ AGCTTAAACC és 12mer 5’ TAAGGAGGTTTA összeépítjük a szakirodalomból ismert módszerekkel, s célszerűen még ezelótt a 6mer oligonukleotidot radioizotóppal jelöljük. Ezt követően a promoter/operétor rákapcsolása a riboszómakötő szekvenciára ugyancsak a szakirodalomból ismert eljárásokkal történik. A pER 103 expressziós plazmid szerkesztése Egy plazmidból, például a pBR 101 plazmid ból, amely a Serratia marcescens triptofán operonjának egy részét tartalmazza, kihasítjuk a 90 bp hosszú promoter/operátor szekvenciát az Eco Rí és Hae III restrikciós enzim segítségével. Ezt a fragmentumot ezután a szintetikus úton előállított RBS-el kapcsoljuk össze DNS-ligáz enzim alkalmazásával. Az így előállított promoter/operátor—RBS-fragmentumot, amely a promoter/operátor szakasz előtt Eco Rí számára felismerhető véggel és az RBS szakasz után a Hindin száméra felismerhető véggel rendelkezik, a pBR 322 plazmidba építjük be, a plazmid 29 bp hosszú Eco Rí - HindlII fragmentumának helyére. Az Így szerkesztett expressziós plazmid (pER 103) hatékonyságát a HindlII helyre beépített gének kifejeződésére nézve, az A altipusú leukocita interferon (IFN-oCA) példáján mutatjuk be. Az IFN-cCA kifejeződése a pER 103 plazmidban Az interferon az emberi sejtekben - hasonlóan más ugyancsak a sejtmembránon keresztül szállított proteinekhez - preproteinként, azaz előszekvenciával rendelkező proteinként szintetizálódik. Ezt az elószek véneiét egy erre specializált enzim hasítja le, amikor a protein molekula a sejtből kilép, s így keletkezik a protein érett formája. Hogy a baktériumokkal érett interferont szintetizáltassuk, annak egyik lehetősége az, hogy DNS szinten eltávolítjuk az előszekvenciét, azaz olyan gént szerkesztünk, amely csak az érett protein szekvenciát kódolja. Az IFN-oCA interferon termelő plazmid szerkesztése A leukocita interferon például 23 aminosavból élló preszekvenciéval rendelkezik, ezután egy cisztein következik, amely a preinterferon hasítása után az .érett' interferon polipeptid első aminosavát képezi. Azoknak a plazmidoknak a szerkesztésénél, amelyek baktériumokban az érett interferon szintetizálásét kell lehetővé tegyék, az interferon gén egy olyan fragmentumának izolálása szükséges, amely pontosan a cisztein kodonjával kezdődik. Ez elé a cisztein kodon elé azután egy ATG metionin kodont kell tenni, hogy a protein szintézis iniciációja lehetővé váljék. Ezt a szerkezetet ezután, megfelelő módon, például a pER 103 expressziós plazraidba építjük be úgy, hogy a ATG iniciációs kodon és az RBS közti távolság a transzláció szempontjából optimális legyen. Az interferon, amelyet egy ilyen plazmiddal baktériumban állítunk elő, az érett polipeptid aminosav szekvenciájával rendelkezik és még egy járulékos metioninnal az amino-terminélis végén. A találmány szerinti IFNcCA-t meghatározó pER 33 interferon termelő plazmidot például az alábbi alapelvek szerint szerkesztjük (előállítását a 4. ábrában sematikusan mutatjuk be): a) Érett interferont meghatározó gén szerkesztése az aminoterminális cisztein kodonjának kihagyásával Az interferon képződéshez szükséges információ kiindulási anyagául például az IFNoCA-t kódoló 1 F7 plazmid cDNS klónjét használjuk, amelyet 1982. május 17-én letétbe helyeztünk a .Deutsche Sammlung von Mikroorganismen' (Griesbach Strasse 8, D-3400 Göttingen, NSZK) törzsgyűjteményében, ahol letéti szám: DSM 2362 (lásd még a P 32 20 116.8 számú német szövetségi köztársasági szabadalmi bejelentést; 1982. május 28.). Ez tartalmazza az interferon gént a pBR 322 plazmid Pst I helyére beépítve. Az IFNcCA génben (ugyanúgy, mint a többi leukocita interferon altípusok esetében), közvetlenül az amino-terminélis ciszteint kódoló TGT után hasítási hely található a Sau 3A számára. Ennek a hasítási helynek a léte képezi az alapját annak a módszernek, amellyel az érett interferon gént szerkesztjük meg megfelelő restrikciós fragmentumokból, például az 1 F7 plazmid interferon specifikus 646 bp hosszú Ava II fragmentumából és 34 bp hosszú Sau 3A - Ava II fragmentumából. b) Az oligonukleotid-komplex előállítása Az így szerkesztett gén 5’ végéhez ezután hozzá kell kapcsolni a hiányzó cisztein kodont és ez elé egy ATG metionin kodont; ezután szükség van még egy ösBzekötő-darabra, amely lehetővé teszi, hogy ezt a szerkezetet beépítsük a pER 103 expressziós plazmid HindlII helyére. Erre a célra a következő 4 oligonukleotidot szintetizáljuk: 5’ TGTGATCTGCCTCA = 14mer, 5’ AGCTTAAAGATG = 12mer, 5’ CAGATCACA = 9mer és 5’ CATCTTTA = 8mer. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
