202277. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS-szekvenciák és ezeket a szekvenciákat tartalmazó plazmidok előállítására és felhasználásuk interferon szintéziséhez

29

HU 202277 B

30

A 3. ábrán a pER 103 nukleotid szekvenciáját mutatjuk be az Eco Rí és a Hin dili hasitási hely között. A plazmid további része a pBR 322 nagy Hin dlll-Eco Rí fragmentumának felel meg. 5

A 4. ábrán a pER 33 interferon termelő plazmid szerkesztésének sémáját mutatjuk be. 4: Pst I hasitási hely, : Sau 3A hasitási hely,+ : Ava II hasitási hely. Az 1 F7 inszertűm restrikciós térképének kivételével a 10 fragmentumok nem mérethűek.

Az 5. ábra egy szekvenáló gél egy olyan részletét mutatja be, amelyen a promoter-RBS-interferon-gén kapcsolat látható. A pER 33 szerkesztéséhez felhasznált minden 15 oligonukleotid fragmentum megtalálható benne. A jobb megértés szempontjából ugyanezt a szekvenciát mégegyszer, mint kétfonalút adjuk meg; az egyes oligonukletid építőköveket beírtuk. 20

A 6. ábra sematikusan ábrázolja a pER 21/1 interferon termelő plazmid szerkesztését. A fragmentumokat, illetve plazmidokat nem mérethűen rajzoltuk meg.

A 7. ábrán a parpER 33 interferon tér- 25 melő plazmid szerkesztését mutatjuk be sematikusan. A fragmentumok, illetve plazmidok ábrái nem mérethűek.

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás humán oC-interferon genetikai anyagát magában hordozó DNS szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy Serratia marcescens triptofán operonjának 90 bp hosszúságú promoter/operátor szekvenciáját egy

5’ TAAGGAGGTTTA

3’ ATTCCTCCAAATTCGA szerkezetű riboszómakötő szekvenciával kapcsoljuk össze, az így létrejött DNS szekvenciához egy linker szekvenciát kapcsolunk, és ezt a DNS szekvenciát oC-interferont meghatározó strukturális génnel kapcsoljuk össze.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy interferont meghatározó strukturális génként humán cC2c interferont kódoló gént alkalmazunk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS szekvenciához az

5’ AGCTTAAAGATG

3’ ATTTCTAC

képletű linker szekvenciát kapcsoljuk.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás a

5’AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3 ’ GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG

t-— Promoter---------------------------GCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTAAGCT

CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCTCCAAATTCGA

------Promoter/operátor--------------------------j----------RBS-------------------------t

Hindii!

i---------------IFN-oC2C-Gén---------------->

T AAAGATGTGTGATCTGCCTCAAA ATTTCTACACACTAGACGGAGTTT I-----linker--------1

képletű DNS szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy a képlet szerinti DNS eleme-45 két kapcsoljuk össze.

5. Eljárás humán oC-interferon genetikai anyagát magában hordozó DNS szekvenciát tartalmazó termelő plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy plazmidba, előnyösen a

50 pER103 expressziós plazmidba az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti, egy vagy több DNS szekvenciát épitünk be, és adott esetben a pPM31 plazmidból izolált par-lókuszt is beviszünk.

55 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal

jellemezve, hogy a plazmidba egy, 4. igénypont szerinti DNS szekvenciát épitünk be.

7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a plazmidba két, 4. igény-60 pont szerinti DNS szekvenciát épitünk be.

8. Az 5. igénypont szerinti eljárás a pER33 termelő plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy a pER103 expressziós plazmidba a 4. igénypont szerinti DNS szekvenciát

65 építjük be.

17