202277. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS-szekvenciák és ezeket a szekvenciákat tartalmazó plazmidok előállítására és felhasználásuk interferon szintéziséhez
1 HU 202277 B 2 A gének baktériumokban tórténó kifejeződésének előfeltétele egy úgynevezett promoter, azaz egy felismerő szekvencia jelenléte, amely a bekteriális polimerázzal kötődik. A promoter lehetővé teszi a mögötte lévő Bzek- 5 venciák transzkripcióját is. Azoknak a géneknek, amelyeknek a termékei mindenkor szintetizálódnak, olyan promoterei vannak, amelyek mindig képesek RNS polimeráz molekulákkal kötődni. A baktériumok más génjei, 10 illetve operonjai szabályozottak, azaz promotereik meghatározott mechanizmusok révén hozzáférhetővé vagy hozzáférhetetlenné válnak. A kívánt géntermékek szintetizálódásának egy másik feltétele az, hogy az* átirt RNS-ek hatékonyan transzlatálódjanak a bakteriális riboszómákon. Shine és Dalgarno [Nature, 254, 34-38 (1975)] közölték, hogy baktériumokban a mRNS 5’ végén lévő nukleotid szekvenciák felelősek a riboszómához történő kötődésért. Jelen találmánynak az a célja, hogy egy ismert promoter segítségével, amely egy új riboszómakötő-linker szekvencián keresztül egy strukturális génhez kapcsolódik, baktérium-idegen proteinek - interferonok - géntechnológiai termelését javítsa. 15 Jelen találmány tárgya tehát az alábbi formulájú DNS szekvencia. 5’ AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3’ GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG k*----------------promoter GCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTA CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCTCCAAATTCGA---------promoter/operátor---------------------------------W ■*------RBS-----------HindlII amelyhez adott esetben a riboszómakótó szekvenciához egy linker szekvencia és egy 30 polipeptidet, előnyösen egy oC-interferont kódoló etrukturgén szekvenciája kapcsolódik olyan formában, hogy ez baktériumok által kifejezhető, és a DNS-szekvenciák kombinációja oly módon történik, hogy a strukturgén 35 DNS-szekvenciája a DNS linker szekvenciához 3’,5’-foszfodi0szter-k0t0B8el kapcsolódik. Ez a szekvencia egy irodalomból ismert promoter szekvenciából és egy irodalomból ismert riboszómakötő szekvenciából álló új 4q kombinációt képvisel. A jelen találmány tárgyát képezi előnyösen azonban’ egy olyan DNS-szekvencia, amelyben a strukturgén az 1F7 klón (DSM 2362) PstI inszertjében lévő DNS-szekvenciával azonos, amely csak érett interferont kódol, és amely a következő képlettel ábrázolható: 5’ AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3' GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG W----------------promoter -------------GCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTAAGCT CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCTCCAAATTCGA-------promoter/operátor--------------------------------* —RBS---------------M HindlII 1— az 1F7 (DSM 2362) klón PstI inszertjében lévő, érett oC-interferont kódoló DNS-szekvencia---------> TAAAGATGTGTGATCTGCCTCAAA 55 ATTTCTACACACTAGACGGAGTTT <------linker--------> A találmány tárgyát képezik továbbá az 60 5’ TAAGGAGGTTTAAGCTTAAAGATGTGT 3’ ATTCCTCCAAATTCGAATTTCTACACACTAG Sau3A 65 képletü DNS-riboszómakötó-/linker szekvencia, az 5’ AGCTTAAAGATGTGT 3’ ATTTCTACACACTAG képletű DNS-linker szekvencia, valamint egy olyan DNS-szekvencia, amely az előbbi linker szekvenciából és az 1F7 klón (DSM 2362) PstI inszertjében lévő, érett oC-interferont ezen interferon amino-terminális ciszteinje nélkül kódoló DNS-szekvenciából áll, amely két részt a Sau3A végeken keresztül úgy ligálunk, hogy a teljes érett cC-interferon kódolva legyen, továbbá az előbb említett szekvenciákat tartalmazó plazmidok, például a pER103 plazmid, amely a 3
