202274. lajstromszámú szabadalom • Eljárás BepI restrikciós endonukleáz előállítására Brevibacterium epidermidisből
3 HU 202274 B 4 szacharóz, 0,2M EDTA és 0,1% brómfenolkék. A rendszerből vett néhány m1 mintát agaróz gélen elektroforetizálunk. A gél etidium-bromidot tartalmaz, melynek jelenlétében a DNS csíkok UV-fényben láthatóvá válnak. Enzimaktivitást jelez, ha egységes esik helyett elkülönülő fragmensek láthatók. Az enzimet tartalmazó egyesitett eluátumot PC pufferral szemben dializáljuk. Az ezt követő tisztítás során PC pufferral ekvilibrált 3x25 cm-es DEAE cellulóz oszlopot alkalmazunk, az elválasztás lineáris gradiens elücióval történik PC pufferben 0,0-0,5 NaCl-ot adagolva. A vizsgálatok alapján a 0,25-0,30M NaCl-dal nyert frakciókat gyűjtjük össze, ezeket ismét dializáljuk. Végül 1,5x15 cm-es Pll foszfocellulóz oszlopon választjuk el a 0,05-0,12M NaCl-dal eluált aktív frakciót, ezt tároló pufferral szemben dializáljuk, mely egyben kb. háromszoros töményitést hoz létre. A nyert BepI enzim hozama 380 egység/9 nedves sejt. Az enzim nem igényel Navagy K-ionokat, Mg2* igénye kb. lOmM, pH optimuma 7,4, hőoptimuma 25-30 °C. A fentiekben alkalmazott táptalajok és pufferek összetétele a következő: YTA táptalaj: Bacto tripton 10 g, Bacto élesztőkivonat 5 g, NaCl, Bacto agar 15 g, csapviz ad. 1 liter. YTB táptalaj: mint YTA, agar hozzáadása nélkül. PC puffer: 0,01M pH=7,4 kálium-foszfát puffer, 0,lmM EDTA, 0,01M 2-merkapto-etanol. tároló puffer: 0,05M KC1, 0,01M pH=7,5 Tris-HCl puffer, 0,lmM EDTA, l,0mM ditiotreitol, 200 ug/nil marhaszérum albumin, 50% glicerin. 2. példa A felismerőhely igazolása Ismert módon elvégezzük pBR 322 plazmid hasítását az azonosnak vélt EnuDII enzimmel, az új BepI enzimmel, illetve kettős hasítást végzünk az előbbiekkel. A kapott fragmensek mindhárom esetben azonosak. (1. ábra). 3. példa Brevibacterium epidermidis MIMNG (NCAIM B) P 001019 törzset az 1. példa szerint tartunk fenn és tenyésztünk. A fermentlé centrifugálásával nyert nedves sejttömegből az enzimet az alábbi módon tisztítjuk: 28 g nedves sejtmasszához 42 ml 0,01M pH=7,4 Tris-HCl puffert adunk, mely 0,01M 2- 5 -merkapto-etanolt tartalmaz. A sejteket ultrahanggal (MSE készülék 20x30 másodperc) feltárjuk, a sejttörmeléket ultracentrifugálással (35 000 rpm, 60 perc) eltávolítjuk. A nyers sejtkivonathoz olvadó jégfürdöben 10 lassú kevertetés mellett streptomicin-szulfátot adunk 5% végkoncentrációig. A kevertetést 60 percen át folytatjuk, majd a keletkezett csapadékot centrifugálással (12 000 rpm 20 percig) eltávolítjuk. A felülúszót egy éj- 15 szakán át PC pufferral szemben (1. példa szerinti összetétel) dializáljuk. A tisztítás következő lépéseként Heparin-sepharose oszlopon (1,6x15 cm-es) történő kromatografálást végzünk. Az eluens PC 20 puffer, mely 0,0-l,0M NaCl-ot tartalmaz. Az enzimaktív frakciókat a 0,095-0,225M NaCl-os tartományban találjuk. A frakciókat egyesítve PC pufferral szemben dializáljuk. Befejező lépésként omega-aminopentil-agaróz 25 (1,6-3,0 cm) oszlopos tisztítást végzünk, ahol az eluens hasonlóan PC pufferben NaCl gradiens. Az aktiv frakciók megjelenése a 0,250 és 0,410M NaCl koncentrációk között várható. A mintákat egyesítés után tároló 30 pufferral szemben dializáljuk, melynek öszszetétele az 1. példa szerinti. A kapott enzim hasítási helyén Maxam-Gilbert szekvenálással ellenőrizzük (Methods Enzymol. 5, 499-560 1980) és eredményét a 35 2. ábrán mutatjuk be. A hasítás helye a CGCG szakasz közepe. 40 45 50 55 60 4. példa Brevibacterium epidermidis MIMNG (NCAIM B) P 001019 törzset 6 havonkénti átoltással YTA táptalajon tartunk fenn. Egy ferde agar tenyészetet lemosunk 5 ml AGK táptalajjal és a szuszpenzióval beoltunk 300 ml AGK táptalajt 1 literes Erlenmeyer lombikban. A tenyésztést rázatással (350 rpm) 27 °C-on 18 órán át folytatjuk, majd a fermentléből a sejtanyagot centrifugálással leválasztjuk (4000 rpm, 30 perc). A nyert biomassza 29 g, ezt az 1. vagy 3. példa szerint feldolgozva, azonos ismérvekkel jellemezhető BepI enzimet nyerünk. Az AGK táptalaj összetétele: aszparagin 1 g glukóz 5 g kukoricalekvárpor 2 g KH2PO4 2 g KH2PO4 MgSOi 0,05 g 0,01 g csapviz 1 liter. 4
