202247. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleotidok és nukleozidok foszforilezésére
1 HU 202247 B 2 (V) általános képletű tio- vagy szeleno-foszfátokat. A reakciót célszerűen 0-80 °C közötti, előnyösen 0-60 ’C közötti, elsősorban 0-30 ‘C közötti hőmérsékleten végezzük. Mint már említettük, a találmány szerinti eljárás során messzemenően figyelembe tudjuk venni az R csoport kémiai természetét, amikor is ez a csoport érzékeny csoportokat vagy molekularészeket is hordozhat. Végállásban védőcsoport nélküli foszfátcsoportot tartalmazó nukleotidok a jelenleg ismert foszfát védőcsoporttal kombinált foszfit-eljárással nem, vagy csak igen nehézkesen állíthatók elő. A triészter-szintézis során gyakran alkalmazott o-klor-fenil-ß-cianoetil-foszfát-védőcsoport kombináció sem eredményez végállású foszfátcsoportokat, mivel az o-klór-fenilcsoport nem hidrolizálható úgy, hogy ß-ciano-etilcsoport-keletkezzék. Az ismert eljárások során ezért a végállású 5’hidroxicsoport foszforilezését nukleotid-trifoszfát, általában adenozin- trifoszfát és egy kináz-enzim, így (T4)-polinukleotid-kináz segítségével végezték. Ez az eljárás azonban igen bonyolult. Az 5’-hidroxilcsoport foszforilezését a találmány értelmében kémiai úton valósítjuk meg, éspedig nemcsak az izolált oligonukleotiden, hanem akár a még hordozóanyagon kötött vegyületen is. A találmány szerinti eljárás olyan kíméletes körülmények között játszódik le, amely nem károsítja a nukleotidot az oligo- vagy polinukleotidot. A találmány szerinti eljárás során azonban a foszfátcsoport bevihető a nukleotid vagy monomer-, oligomer- vagy polimemukleotid más pontjára is például a 3’-hidroxicsoport vagy -csoportok foszforilezésével, vagy ribonukleozidok vagy ribonukleotidok esetében a 2’-pozíció foszforilezésével. A találmány szerinti eljárást az alábbiakban a nukleotidok közismerten nehézkes példáján mutatjuk be. Ez azonban nem jelenti az oltalmi kör korlátozását, mivel a nukleotidok foszforilezése általánosan reprezentálja a foszfátcsoport bevitelét. A (III) általános képletű foszforilező reagens előállítása: I. I. példa Foszforossav-metil-észter-diizopropil-amid-klorid 127 g (0,96 mól) foszforossav-metilészter-dikloridot felveszünk 250 ml abszolút éterből és 250 ml abszolút pentánból álló keverékben, majd erős kevertetés közben nitrogén-atmoszféra alatt -15 °C hőmérsékleten 270 ml (1,92 mól) díizopropil-amin 100 ml abszolút éterben és 100 ml abszolút pentánban felvett oldatát csepegtetjük hozzá 2 óra alatt. A reakcióelegyet kevertetés közben hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni, majd 2 órán keresztül tovább kevertetjük. Ezután ismét -15 ‘C hőmérsékletre hűtjük, és a hidrokloridot inert gáz- atmoszféra alatt végrehajtott szűréssel eltávolítjuk a reakcióoldatból. A szűrőnuccsot azonos térfogatú abszolút éter és abszolút pentán lehűtöt elegyének 750 ml-jével mossuk. A szűrletet egyesítjük és az oldószert vízsugárvákuumban leszívatjuk. A maradékot 80 cm-es Vigreux-kolonnán magas vákuumban kétszer desztilláljuk. így 80 g főfrakciót kapunk, forráspont 38-41 *C/0,1 mbar, amely 31P-NMR szerint 99%-ban egységes (5-185 ppm). 2. példa Foszforossav-metil-észter-[$-(p-nitro-fenil)-etil■észter]-diizopropil-amid [(VI) képlet] 5,01 g (30 mmól) száraz 2-(p-nitro-fenil)-etanolt 60 ml frissen desztillált metilén-kloridban oldunk és 24 ml diizopropil-etil-aminnal elegyítjük. A reakcióelegyet mintegy 0 °C hőmérsékletre hűtjük, és kevertetés közben 5 perc alatt 6 ml (33 mmól) foszforossav-metil-észter-diizopropil-amid-kloridot csepegtetünk hozzá, majd további 10 percen keresztül ezen a hőmérsékleten kevertetjük. Ezután 750 ml etil-acetáttal hígítjuk, amelyet előzőleg 450 ml (pH-7) foszfátpufferrel mossuk. Az etil-acetátos fázist háromszor 450 ml foszfátpufferral (pH-7) kirázzuk, nátrium-szulfáton szárítjuk és bepároljuk. A kapott olajat 30 °C hőmérsékleten magas vákkumban szárítjuk. így 9 g olajat kapunk, amelyet 31P-NMR szerint 86%-ban egységes. Rövid Kiesel- géllel töltött oszlopon végzett kromatográfiával (eluens: etil- acetát/metilén-klorid/trietil-amin 5:4:1) a termék tovább dúsítható (31P-NMR: 95%). Az így kapott olaj hűtőszekrényben (-20 °C) kristályosodik ki. 3iP-NMR: 5=149 ppm ‘H-NMR: P-O-CH2-CH2- 5=3,75 ppm, m (2) P-O-CH2-CH2- 5-2,98 ppm, t (2) P-OCH3 5-3,35 ppm, d (3) m-multiplett (intenzitás) s-szingulett d-duplett t-triplett. 3. példa Foszforossav-(metil-észter)-(2-ciano-etil-észter)diizopropil- amid [(VIII) képlet] A 2. példával analóg módon 0,68 ml (10 mmól) 2-ciano-etanolt 2 ml (11 mmól) foszforossav-metilészter-diizopropil-amid-kloriddal reagáltatunk 8 ml diizopropil-amid jelenlétében 20 ml frissen desztillált metilén-kloridban. 30 °C hőmérsékleten magas vákuumban végzett szárítás után 2,5 g olajat kapunk, amely 31P-NMR szerint 94% (VIII) képletű vegyületet tartalmaz. 31P-NMR: 5=150 ppm 'H-NMR: P-OCH?CH?CN 5=3,75 ppm, m (2) P-OCH7CH7-CN 5-2,60 ppm, t (2) P-OCH-i 5=3,35 ppm, d (3) 4. példa Foszforossav-[2-(p-nitro-fenil)-etil-észter]-diklorid 5 g (30 mmól) 2-(p-nitro-fenil)-etanolt 100 ml abszolút éterben oldunk és 40 perc alatt -20 ”C és -30 °C közötti hőmérsékleten kevertetés közben cseppenként 25,5 ml (150 mmól) frissen desztillált foszfor-trikloriddal elegyítjük. Az étert 0 °C hőmérsékleten vízsugárvákuumbvan leszívatjuk, majd a felesleges foszfor-trikloridot magas vákuumban eltávolítjuk és a visszamaradó olajat magas vákuumban szárítjuk. 31P-NMR: 5-179,8 ppm az összes foszfor 93%-a. 5. példa Foszforossav-diizopropil-amid-diklorid 87 ml (1 mól) foszfor-trikloridot 800 ml petroléterben oldunk, az oldatot 5 "C hőmérsékletre hűtjük, majd 283 ml (2 mól) diizopropil-amin 660 ml pet-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
