202244. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új vírusellenes hatású purin-származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202244 B 2 A 14. példa szerinti vegyület előállítása 2-amino-6-metoxi-9-[2-(foszfono-metoxi)etoxi]pur in 0,10 g (0,31 mmól) 6-klór-9-[2-foszfono-metoxi)etoxi]guanin 3 ml metanolos oldatához 0,59 ml 30 tömeg %-os metanolos nátrium oldatot adunk (3,1 mmól) és az elegyet 50 °C-on 5 óra hosszat keverjük. Az oldatot szobahőmérsékletre hűtjük, 20 ml metanollal hígítjuk és Amberlite IR-120(plus) gyantát adunk hozzá. Ahhoz, hogy az oldat pH-ja 2,5 legyen kis feleslegű gyantát adunk hozzá. Az oldatot leszűrjük, a gyantát 30 ml 1:1 arányú metanol-víz eleggyel mossuk és az egyesített szűrleteket csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékot reverz-fázisú oszlopkromatográfiával szilíciumdioxidon tisztítjuk. Eluálószerként vizet használunk. 70 mg, 71% cím szerinti vegyületet kapunk. UV: vmax (H2O) 248 (e 8250)nm. >H NMR: 5H [(CD3)2] 3,38 (2H, d, J-8,35 Hz, OCH2P), 3,70 (2H, m, CH2), 3,95 (3H, s, OCH3), 4,37 (2H, m, NOCH2), 4,4-5,0 (2H, széles s, D2O cserélhető PO(OH)2), 6,73 (2H, széles s D2O cserélhető NH2). 8,19 (1H, s, H-8). A 15. példa szerinti vegyület előállítása 0,323 g (1,57 mmól) diciklohexil-karbodiimid 15 ml terc-butil- alkohollal és 2 ml dimetil-fonnamiddal készített oldatát hozzácsepegtetjük 30 perc alatt, 0,105 g 9-[3-hidroxi-2- (foszfono-metoxi)propoxi]guanin és 0,092 g 0,31 mmól N,N-diciklohexil-4-morfolino-karboxamidin 10 ml 50%-os vizes terc-butil-alkohollal készített oldatához. A reakcióelegyet visszafolyató hűtő alatt 8 óra hosszat melegítjük, majd szobahőmérsékletre hagyjuk egész éjjel hűlni, majd leszűrjük. A szűrletet szárazra pároljuk, a maradékhoz vizet adunk és az elegyet üvegszálszűrőpapíron keresztül leszűrjük. A szűrletet szárazra pároljuk és a kapott szilárd anyagot DEAE-Sephadex HCOj formájú oszlopon tisztítjuk és vizes trietil-ammónium- karbonát lineáris gradiensével eluáljuk. (pH 7,5 0,05 móltól 0,25 mólig) A kívánt komponens a 0,15 mólos frakciókban található. A megfelelő frakciókat egyesítjük, szárazra pároljuk, etanol és víz 3:1 arányú elegyével háromszor lepároljuk, ezáltal valamennyi trietil-amint eltávolítjuk. A maradékot nátriumformává alakítjuk úgy, hogy DOWEX 50W-X8 (Na+) gyantán engedjük keresztül a vizes oldatot és vízzel eluáljuk. A megfelelő frakciókat egyesítjük és liofilizálva 58 mg fehér amorf szilárd anyagot kapunk. UV: Vmax (H20) 253 (e ll,600)nm. IR: Vmax (KBr) 3408, 3140, 2956, 1696, 1611, 1529, 1479, 1382, 1323, 1239, 1210, 1176, 1082, 1044, 1012, 961, 820, 792, 777 cm1. JH- NMR: 8 H [(CD3)2SO] 3,40 (1H, dd, J-13,1 Hz, J-3,4 Hz, OCHbP), 3,54 (1H, dd, J—13,1 Hz, J-8,4 Hz, OCHAP), 3,77 (1H, m, CH), 3,91 (1H, ddd, J-11,5 Hz, J-15,0 Hz, J-2,3 Hz, CHCHbOP), 4,11 (1H, ddd, J-11,5 Hz, J-9,7 Hz, J-4,3 Hz, CHCHcVAOP), 4,20 (1H, dd, J-10,6 Hz, J-3,4 Hz, NOCHb), 4,29 (1H, dd, J-10,6 Hz, J-6,6 Hz, NOCHa), 6,85 (2H, széles s, D2Ó cserélhető NH2), 7,90 (1H, s, H-8), 10,99 (1H széles s, D20 cserélhető NH). 16. példa szerinti vegyület előállítása 0,16 g (0,33 mmól) 9-[3-acetoxi-2-(dietoxi-foszforil-metoxi) propoxi]-6-klór-2-formamido-purin 5 ml etanolos ammóniás oldatát 120 'C-on 5 óra hosszat melegítjük lezárt edényben. Az oldatot szobahőmérsékletre hagyjuk lehűlni és az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítva barna maradékot kapunk. A maradékot preparatív vékonyréteg kromatográfiásan tisztítjuk, diklór-metán és metanol 80:20 arányú elegyével. 0,065 g 2,6-diamino-9-[2- (dietoxi-foszforilmetoxi)-3-hidroxi-propoxi] purint kapunk színtelen gumiszerű anyag formájában. A 0,06 g (0,15 mmól) gumiszerű anyagot feloldjuk 1 ml vízmentes dimetilformamidban és hozzáadunk 0,3 ml (1,53 mmól) trimetil-szililbromidot. 3 óra múlva szobahőmérsékleten az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk és a kapott 50%-os vizes acetonban feloldjuk. Az oldószert lepárolva szilárd anyagot kapunk, melyet forró vízből kristályosítunk és így 0,014 g 27% cím szerinti vegyület keletkezik. 'H-NMR: 8H [(CD3)2SO] 3,46-3,60 (2H, m, CH2OH), 3,65-3,85 (3H, m, CHOCH2P), 4,24 (1H, m, NOCHb), 4,42 (1H, m, NOCHa), 6,03 (2H, széles s, D2O cserélhető NH2), 6,88 (2H, széles s, D20 cserélhető NH2), 8,02 (1H, s, H-8), 3,3 (széles, s, D20 cserélhető OH, PO(OH)2, víz oldószerben), m/z (FAB, tioglicerin mátrix) 335 (MH+, 6%) Vírusellenes hatás 1. Herpesz szimplex 1 és 2 vírusok kimutatására szolgáló foltcsökkenési teszt Verő vagy MRC-5 sejteket tenyésztünk összefolyásig 24 üreges multiedényekben (üreg átmérő másfél cm). Az áztatott sejt monofázisokat megfertőztük kb. 50 fertőző herpesz szimplex 1 vírussal (HSV-1, HFEM törzs) vagy szimplex 2 (HSV-2, MS törzs) 100 pl foszfát-pufferezett fiziológiai sóoldatban. A vírus 1 óra alatt adszorbeálódott szobahőmérsékleten. Az adszorpció után a maradék oltóanyagot eltávolítottuk az egyes üregekből és 0,5 ml Eagle-féle MEM-mel helyettesítettük, amely 5% újszülött borjúszérumot és 0,5% agarózt tartalmaz (A37). Az agaróz beállása után a tesztvegyület hígításait adtuk hozzá, melyeket az 5% újszülött borjúszérumot tartalmazó Eagle-féle MÉM- ben készítettünk el és mindegyik üregbe 0,5 ml folyadékot helyeztünk feleslegben. A tesztvegyületet úgy hígítottuk, hogy a következő koncentrációsorozatot kapjuk: 200, 60, 20, 6.....0,06 pg/ml, s a végső koncentrációtartomány 0,03 pg/ml és 100 pg/ml között volt. A ferttőzött tenyészeteket 37 'C-on nedvesített 5% széndioxidot tartalmazó atmoszférában inkubáltuk, amíg a foltok tisztán láthatóvá nem váltak. (2 vagy 3 nap a verő sejtek és rendszerint 1 nap az MRC-5 sejtek esetében). 2. Varicella Zoszter vírusra végzett foltcsökkentő teszt MRC-5 sejteket tenyésztettünk összefolyásig 24 üreges multiedényekben (üregátmérő 1,5 cm). Az áztatott sejt monofázisokat egyenként megfertőztük 50 fertőzött varicella zoszter vírus részecskékkel (VZV ellen törzs) 100 pl foszfát-pufferezett fiziológiai sőoldatban. A vírus egy óra hosszat adszorbeálódik szobahőmérsékleten. Adszorpció után a maradék oltóanyagot eltávolítottuk minden üregből és helyette 0,5 ml Eagle-féle MEM-et helyeztünk, amely 5% fő inaktivált magzati borjúszérumot tartalmaz, valamint 0,9% agarózt (A37). Az agaróz beállása után 5% hőinaktivált magzati borjúszérumot tartalmazó Eag-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
