202104. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1-karboxi-3,4-metiléndioxi-8-metoxi-fenantrént tartalmazó immunstimuláló hatású gyógyszerkészítmények előállítására
HU 202104B 3 4 letek megkezdése előtt 5 napon át szoktattuk a laboratóriumi körülményekhez. Az állatok a patkányok és egerek részére szokásos szemcsés standard eledelt (Altromin Nr. 1324) kapták és csapvizet tetszés szerint. Az állatokat tioglikolát standarddal három 5 makrofág-stimulálhatóságra megvizsgáltuk, ennél a vizsgálatnál jó pozitív reakciókat mutattak. Adagolás és alkalmazás A vegyületet vizes oldatban (0,5 mg/ml) a követ- 10 kező dózisokban alkalmaztuk; intraperitoneálisan: 20 p.g/kg 500 pg/kg 5mg/kg 15 A különböző dózisok alkalmazásához a törzsoldat hígítása a következő volt: 20 pg/kg 1 pg/ml 20 500 pg/kg 25 pg/ml 5 mgflcg 250 pg/ml és ezekből mindenkor 0,4 ml-t használtunk. 25 Alkalmazási séma 1 csoport - 5 egér Előkezelés: a) három beadás három egymást követő napon, a negyedik napon a makrofágok kitermelése, 30 b) egy beadás közvetlenül a makrofágok kitermelése előtt. A makro/ág-sejtszuszpenzió előállítása és a fagocitózis 35 A kísérlet elve: Immunológiásan aktiváló anyagok beadása után a kísérleti állatokban a makrofágok stimulálódnak és a monociták makrofágokká differenciálódnak. A kidifferenciálódott, stimulált makrofágok izolálás 40 után is képesek a megfelelő antitestekkel opszonifikált antigénstruktúrákat, ebben az esetben az üriieritrocitákat in vitro fagocitálni. A fagocitált eritrociták (vörösvérsejtek) mikroszkóposán felismerhetők. 45 A kísérlet elvégzése: Megfelelő előkezelés után az egereket nyakcsigolyájuk eltörésével megöljük. A hashártyát feltárjuk, és 5% magzati borjúszérumot és 0,2% heparint tartalmazó 4 ml DMEM tápoldatot intraperitoneálisan beadunk. Körülbelül 30 mp masszázs után fecskendővel 3 ml sejtszuszpenziót leszívunk, és 0 'Clos hűtőfürdőben levő polipropiléncsövecs- kébe eresztjük. Mindegyik csoportból 1 egeret arra használunk, hogy az izzadmányban a sejtkoncentrációt megállapítsuk, körülbelül 4 x 105 sejt/ml koncentrációt állítunk be. 50 55 Adherens makrofágok izolálása: 60 A makrofágokat és monocitákat az izolált sejtpopulációból úgy választjuk ki, hogy a sejtpopulációt fedőlemezeken inkubáljuk, ilyenkor a makrofágok és a monociták a lemezhez tapadnak, a többi sejt nem. 24 tartállyal ellátott szövettenyésztő lemezek- 65 re (polisztirol, Costar) kerek fedőlemezkéket helyezünk és ezekre 5% magzati borjúszérumot tartalmazó 0,25 ml DMEM tápoldatot rétegzünk. A sejtek egyenletes elosztása céljából a lemezeket rázógépre tesszük és rázás közben (5 perc, körülbelül 200 fordVperc) mindegyik adaghoz 0,25 ml sejtszuszpenziót pipettázunk. Ezután a szövettenyésztő lemezeket 1 órán át 37 "C hőmérsékletű, 8% C02-ot tartalmazó tenyésztőszekrényben inkubáljuk. Az inkubálás után a nem tapadó sejteket leszivatjuk és a többit 5% magzati borjúszérumot tartalmazó 0,25 ml DMEM tápoldattal kétszer mossuk. Az ürü-vörösvérsejtek opszonifikálása: Az 1 ml ürüvért kétszer 4 ml PBS/BSA oldattal mossuk (centrifugálás 10 perc, 500 xg). A mosott vért 1:50 arányban PBS/BSA oldattal 1:200 arányban hígítjuk. A hígított ürüvért és a hígított antiszérumot 1:1 arányban keverjük és 1,5 órán át kíméletesen rázva (körülbelül 80 ford ./perc) inkubáljuk. Fagocitózis: A szövettenyésztő lemezek mindegyik tartályába, amely az adherens makrofágokat a fedőlemezkéken tartalmazza, 0,5 ml opszonifikált vörösvérsejt-szuszpenziót pipettázunk. A lemezeket 20 percig 37 "C-on, 8% CO2 jelenlétében inkubáljuk. Ezután a feleslegben levő vörösvérsejteket leszívatjuk és a fedőlemezkéket 0,5% magzati borjúszérumot tartalmazó DMEM tápoldattal kétszer mossuk. A nem fagocitált vörösvérsejtek oldásához ezeket minden esetben 1 ml NH4Cl-trisz-pufferral kezeljük (úgy találtuk, hogy 3,75 perc behatási idő megfelel). A puffer leszívatása után a fedőlemezkéket PBS/BSA oldattal kétszer mossuk. A fagocitózis kimutatása (festési technikák): A fagocitózis után a makrofágokat Pappenheum szerint kombinált May-Grünwald-Giemsa eljárással megfestjük. A festést a szövettenyésztő tálak tartályaiban végezzük. 5 perc Konc. May-Grünwald-oldat, leszívatva, 3 perc kétszer desztillált H2O, minimum 85%-os foszforsavval 7,0 pH-értékre beállítva, leszívatva, 9 perc Giemsa oldat 1:40 hígításban és használat előtt megszűrve, leszívatva, desztillált vízzel palackból leöblítve. A sejtmagok a festés után vörös-ibolya színűek, a citoplazma világoskék. A fagocitált vörösvérsejtek halvány rózsaszínűek. A mikroszkóp-preparátumokat levegőn szárítjuk, majd „Eukitt” ragasztóval tárgylemezekre ragasztjuk (három preparátum/egér). Mikroszkópos kiértékelés Egy egér három mikroszkóp-preparátumából kettőt számoltunk meg. Olajimmerziós, 1000-szeres nagyítású Zeiss mikroszkópot használtunk. A harmadik preparátumot csak akkor használtuk fel, ha két preparátumból az eredmény nem volt egyértelmű. Preparátumokként 300 sejtet számláltunk, és ezeket a fagocitózis-aktivitástól függően a vörösvérsejt/makrofág növekvő számával osztályokba soroltuk. 3
