202063. lajstromszámú szabadalom • Nyújtott hatású biológiai peszticidet tartalmazó készítmény és eljárás a hatóanyag és a termelő sejtek előállítására
HU 202063B 19 20 6. táblázat Hőkezelt P. fluorescens biológiai mérése Kezelés (70*C) Idő (perc) Élő sejtek száma/ /összes sejtek Elölt lárvák száma/ összes lárva Elölt lárvák %-a 3 2.10E*/5,5.10E10 8/8 100 5 2.10E6/5,5.10E10 8/8 100 10 0/5.5.10E10 8/7 100 P. fluorescens+Bacillus thüringiensis toxin (pCH törzs) lugollal kezelt sejtjei fennmaradásának elemzését végezzük el melegházban (1) Romaine saláta leveleit bepermetezve a peszticidet tartalmazó sejtekkel; (2) a kezelt növényeket melegházi körülmények között tartva 19 napig (a melegház UV-fényáteresztő tetővel van fedve), és (3) a leveleken megmaradó káposztalepkehemyó elleni peszticid aktivitást mérve, levél-gátlású méréssel. A Bacillus thüringiensis toxin mérése az etetési gátlással azonos azzal, amelyet korábban leírtunk, a növények bepermetezésének módszere pedig az 5. példában van leírva. Ebben a kísérletben 1,0 toxin-aktivitási szint ekvivalens azzal a peszticid aktivitással, amelyet 0,19 g Dipel/100 ml permettel érünk el, mintegy 10 ml/növény aránynál (azaz éppen a lecsurgás előtti állapotnál). Amint a 7. táblázatban látható, 11 nap után a Pseudomonas készítmények még teljesen aktivak, míg a Dipel-es minta elveszti kezdeti aktivitásának 2/3-át. Mi úgy értelmezzük, hogy ezek az adatok azt jelentik, hogy a rögzített Pseudomonas sejt bizonyos módon védi a peszticid toxint az inaktiválódástól a levél felületén. 7. táblázat Melegházi fennmaradási adatok Nap pCH Aktivitás Dipel 1 0,75 1,0 5 1,15 0,85 8 1.1 1.2 11 1,0 0,3 19 0,13 0,01 A fenti eredményekből nyilvánvaló, hogy a toxint tartalmazó elölt baktériumok sok előnyt nyújtanak, miközben az élő baktériumok peszticid aktivitásának egészétvagyjelentősrészétmegőrzik. Az élettelen baktériumok fenntartása tároláshoz, szárításhoz és alkalmazáshoz sokkal kényelmesebb és gazdaságosabb, mint az élő organizmusok alkalmazása. Ugyanakkor az organizmusok a toxinok beburkolásos védelmét nyúj tják úgy, hogy fenntartják a toxin biológiai aktivitását hosszú időtartamon át. Ezen kívül a proteázok denaturálása megakadályozza a polipeptid peszticidek proteolitikus elbomlását. Az organizmusok elölésének különböző módjait lehet alkalmazni anélkül, hogy szerkezetüket szétzúznánk vagy denaturálnánk a fehérje toxint, így a kívánt peszticid aktivitása megmarad. Ezek a peszticidkompozíciók alkalmasak kiszerelésekhez való felhasználásra és növényekhez vagy növényi termékekhez való alkalmazásra. Bár a jelen találmány bizonyos részleteit is leírtuk a szemléltetés céljából, és példákat adtunk meg a jobb megér tés céljából, nyüvánvaló, hogy bizonyos változtatások és módosítások végrehajthatók a gyakorlatban, amelyek a mellékelt igénypontok oltalmi körén belül esnek. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás nyú j to tt hatású peszticidek előállítására, azzal jellemezve, hogy a) a Bacillus thüringiensis törzs vagy valamely mutánsa vagy variánsa érintetlen sejtjeit kémiai reagensekkel kezeljük, vagy b) a peszticidet Escherichia coli vagy Pseudomonas fluorescens törzsekben a Bacillus thüringiensis delta-endotoxinát kódoló heterológ gén kifejeződése útján közvetve vagy közvetlenül termeljük, és kívánt esetben kémiai reagensekkel kezeljük. 2. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás, azzal jellemezve, hogyazNRRLB-3792számondeponáltBacillus thüringiensis var. Kurstaki HD-1 sejtjeit alkalmazzuk. 3. Az 1. igénypont szerinti a) vagy b) eljárás, azzal jellemezve, hogy kémiai reagensként lugol-oldatot vagy formalint használunk. 4. Az 1. igénypont szerinti b) eljárás, azzal jellemezve, hogy a peszticidet E. coli NRRL B-15976 vagy Pseudomonas fluorescens NRRL B-15977 törzsekben termeljük. 5. Nyújtott hatású, biológiai peszticid-tartalmú készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként 0,01-95 tömeg%-ban az 1-4. igénypont szerint termelt peszticidet tartalmaz, legalább egy szokásos, szilárd vagy f olyekony hordozóanyaggal együ 11. 6. Eljárás lényegében érintetlen, intracelluláris peszticid toxint tartalmazó különálló E. coli vagy Pseudomonas fluorescens mikroorganizmus sejtek előállítására, azzal jellemezve, hogy a Bacillus thüringiensis delta-endotoxint kódoló heterológ gént tartalmazó E. coli vagy Pseudomonas fluorescens törzseket tenyésztjük, majd a sejteket kémiai vagy fizikai, protcáz deaktiváló vagy sejtfal-erősítő körülmények között elöljük. 7. Eljárás az 1. igénypont b) eljárásában alkalmazott E. coli mikroorganizmus törzs előállítására, azzal jellemezve, hogy Escherichia coli sejtjeibe a 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
