201972. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumor ellenes 4'-dezoxi-13(S)-dihidro-4'-jód-doxorubicin-hidroklorid előállítására a 4'-dezoxi-4'-jód-doxorubicin sztereoszelektív mikrobiológiai redukciójával
HU 201972 B A találmány tárgya doxorubicin-származék előállítására szolgáló eljárás. Közelebbről a találmány tárgya eljárás a (II) képletű 4’-dezoxi-13(S)-dihidro-4’-jód-doxorubicin-hidrokloridjának előállítására. Az (I) képletű 4’-dezoxi-4’-jód-doxorubicin 13. szénatomján levő keton funkciós csoportjának redukciójához egy, a Streptomyces törzshöz tartozó mikroorganizmust használva, specifikusan a 4’- 13(S)-dihidro-4’-jód-doxorubicint nyerjük, mely a 4’-dezoxi-13-dihidro-4’-jód-doxorubicin két lehetséges C-13-s sztereoizomerjének az egyike. A (II) képletű új vegyület, melyet a továbbiakban FCE 24883-ként jelölünk, daganatellenes készítményként használható és mesterségesen keltett daganatokra az (I) képletű 4’-dezoxi-4’-jód-doxorubicinnal összevethető hatást mutat. A sztereoeszelektív mikrobiális redukció szubsztrátja egy szemiszintetikus doxorubicin-származék, melyet az 1984. március 20-án közzétett 4 438105 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban írtunk le. A találmány tárgya az a bioszintetikus eljárás, amely azzal jellemezhető, hogy a Strepromyces peucetius M87 F.I.-vel jelölt egyik mutánsa, melyet a Német Mikroorganizmus Gyűjtemény tartalmaz, és DMS 2444 számmal jelöl, sztereoszelektíven redukálja az (I) képletű 4’-dezoxi-4’-jód doxorubicin 13-keton funkciós csoportját. A (II) képletű FCE 24883, mely az eljárás során keletkezik, felhalmozódik a fermentációs táptalajba, s onnan kinyerhető, betöményíthető és tisztítható. A jelen találmány tárgya tehát eljárás a (II) képletű 4’-dezoxi-13(S)-dihidro-4’-jód-doxorubicin hidroklorid-sójának az előállítására, ahol az eljárás magában foglalja az M87 F.I. (DSM 2444) Streptomyces peucetius törzs tenyésztését 4’-dezoxi-4’jód-doxorubicin jelenlétében, és a képződő 4’-dezoxi-13(S)-dihidro-4’-jód-doxorubicin kinyerését hidrokloridsó formájában. A Streptomyces peucetius subsp. aureus ATCC 31428-t (tulajdonságait leírja: Biotechnoi. Bioeng. 11; 1101-1110,1969) mutagén ágansként nitrozo-guanidint használva nyerhető az M 87 F. I. Streptomyces peucetius törzs, mely az (I) képletű vegyület szelektíven a (II) képletű vegyületté alakítja. Az M 87 F. I. jelű S. peucetius törzsnek a Német Mikroorganizmus Gyűjtemény, ahol a törzset az állandó gyűjteménybe helyezték, a DSM 2444-es letéti számot adta. A mutáns M 87 F. I. törzs morfológiailag nem különböztethető meg az S.peucetius ATCC 31428- tól, de a két kultúra tisztán elkülöníthető fejlődési és biokémiai tulajdonságok alapján. A mutáns M 87 F. I. törzs nem termeli agar táptalajon azt a citromsárga oldható pigmentet, amely annyira jellemző az S. peucetius ATCC 31428-ra. Ezen túlmenően a mutáns M 87 F. I. az (I) képletű vegyület szelektíven átalakítja a (II) vegyületté, míg a Streptomyces peucetius AZCC 31 428 nem szelektív ebben a tekintetben. Az M 87 F. I. mutánst ez a tulajdonsága nagyon hasznossá teszi, ahogy ezt az előzőekben már jeleztük. A jelen találmány tárgyát képező sztereoszelektív biotranszformáció a Streptomyces peucetius faj 1 M87 F. I. törzse növekvő kultúrájának jelenlétében játszódik le, amennyiben az inkubációs periódus alatt az (I) képletű vegyület hidroklorid sóját szubsztártként adagoljuk a baktérium kultúrához. Az (I) képletű vegyület hidroklorid sóját steril desztillált vízben oldva adagolhatjuk. A tenyészetben az (I) képletű vegyület előnyös koncentráció tartománya 50-200 g/dm3. A tenyésztéshez használt tápoldat szénforrásként asszimilálható szénhidrátot, nitrogénforrásként asszimilálható N-vegyületet, például fehérje-természetű anyagot tartalmaz. Előnyös szénforrások a következők: szacharóz, glicerin, keményítő, kukoricakeményítő, dextrin, melasz és hasonlók. Előnyös N-források a következők: kukorica áztatólé, élesztőkivonat, kazein, halliszt, szárított sörélesztő, szójaliszt, gyapotmagliszt, kukoricaliszt, szeszéletsztő, állati pepton, húskivonat, ammóniumsók és hasonlók. A felsorolt szén- és nitrogénforrások kombinációi előnyösen használhatók. Nyomelemek, mint például cink, magnézium, mangán, kobalt, vas nem szükségesek, mivel a fermentációhoz vezetékes vizet és tisztítatlan anyagokat használunk, majd az összeállítást követően sterilizáljuk a rendszert. A biotranszformációs folyamat időigénye 72 óra és 5 nap közötti tartományba esik. A folyamat alatt az inkubációs hőmérséklet 27- 30 °C között lehet, előnyös a 29 °C-os inkubálás. A reaktort (250 fordulat/pe4rc) keveréssel levegőztetjük vagy steril levegő befúvatásával segítjük a mikroorganizmusok szaporodását; ez egyben a kívánt átalakítási folyamat hatékonyságát is növeli. Analitikai módszerek A mikrobiológiai átalakítás folyamatát a fermentációs rendszerből különböző idő-intervallumonként vett mintasorozattal lehet nyomonkövetni. A mintákat pH 8-on 9:1 arányú diklór-metán-metanol eleggyel extraháljuk. A szerves fázist kloroformmetanol-ecetsav-víz 80:20:7:2 (tf%) arányú elegyében vékonyrétegkromatográfiásan vizsgálva, az FCE24883 (ÍIV képletű) vegyület a 0,50 Rf értéknél jelentkezik, míg az (I) képletű 4’-dezoxi-4’-jód-doxorubicin a 0,60-as Rf értéknél. A ként antraciklin mennyiségi meghatározásánál a futtatást az előbb említett eluenssel végezve, az adott Rf értékeknek megfelelően a vörösre színeződött foltokat kikaparjuk, majd metanolos extrakció után extinkciójukat 496 nm-en spektrofotometráljuk. Elválasztási módszer Az egész fermentációs rendszert, melyben az (I) képletű vegyületet a (II) képletű FCE 24883-má kívánjuk alakítani, kovaföld segítségével szűrjük. A vörös micéliumokkal átszőtt pogácsát vízzel elegyedő szerves oldószerrel, például metanollal vagy egyéb alacsony szénatomszámú alkohollal, dioxánnal, acetonitrillel, acetonnal extraháljuk. Az extrakcióhoz előnyösen acetont használunk. Az extraktumokat összegyűjtjük, csökkentett nyomáson betöményítjük, elegyítjük a kovaföldes szűrés szűrletével, pH-ját 8-ra beállítjuk, s vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, n-butanollal, kloroformmal, diklór-metánnal vagy előnyösen diklór-metán-me-2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
