201966. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hialuronsav-észterek és sóik, ezeket hatóanyagként vagy hordozóként tartalmazó gyógyszerkészítmények, valamint hialuronsav-észterekből képzett filmek és szálak előállítására
HU 201966 B piridinium-kloridot tartalmazó 0,1 mólos nátriumklorid oldattal. Az elegyet centrifugáljuk és a felülúszót elöntjük. A csapadékot 3 liter, 0,30 mólos, 0,05% cetil-piridinium-kloridot tartalmazó nátrium-klorid oldatban diszpergáljuk. Az elegyet keverjük, és mind a csapadékot, mind a tiszta folyadékot összegyűjtjük. Az extrahálást további három alkalommal megismételjük, minden esetben ugyanennek a vizes oldatnak 0,5 literét használva. Végül eltávolítjuk a csapadék maradékát, és a tiszta folyadékokat egy tartályba gyűjtjük össze. A folyadék hőmérsékletét folyamatos keverés mellett 50 °C-ra állítjuk be. A folyadékot ezután nátriumkloriddal 0,23 mólosra állítjuk be. Hozzáadunk 1 g cetil-piridinium-kloridot és további 12 órán át keverjük. Az elegyet lehűtjük 25 °C-ra, majd először CeliteR-en, majd szűrőn átszűrjük. Ezután ismét molekuláris ultraszűrést alkalmazunk, 30.000 kizárási határú molekulaszűrőn, az eredeti térfogat háromszorosát használva, 0,33 mólos nátrium-klorid oldat hozzáadásával. A nátrium-klorid oldat hozzáadását megszüntetjük, és a térfogatot az eredeti 1/4-ére csökkentjük. Az így koncentrált oldatot keverés közben (60 fordulat/perc), 25 °C-on, 3 térfogat 95%-os etanol hozzáadásával kicsapjuk. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, és a felülúszót elöntjük. A csapadékot feloldjuk 1 liter 0,01 mólos nátrium-klorid oldatban, és a kicsapást 3 térfogat 95%-os etanol hozzáadásával megismételjük. A csapadékot összegyűjtjük és először háromszor 74%-os etanollal, majd háromszor abszolút etanollal végül pedig háromszor abszolút acetonnai mossuk. Az így kapott termék (Hyalastine + Hyalectine frakció) átlagos molekulatömege 250.000-350.000. A HY kitermelés az eredeti friss szövetre számítva 0,6%. B. példa A Hyalastine frakció kinyerése az A példában kapott elegyből Az A. példában kapott elegyet feloldjuk kétszer desztillált, pirogén-mentes vízben, 10 mg termék/1 ml víz mennyiségben. A kapott oldatot 200.000 kizárási határú molekulaszűrőn át szűrjük, majd a membránon víz hozzáadása nélkül koncentráljuk. A molekulaszűrés során a 200.000-nél nagyobb molekulatömegű molekulák nem haladnak át a szűrőn, míg a kisebb molekulák a vízzel együtt áthaladnak a membránon. A szűrés során vizet nem adunk, így a térfogat csökken, ezért a 200.000-nél nagyobb molekulatömegű molekulák koncentrációja nő. A terméket addig ultraszűrjük, míg a membránon fennmaradt térfogat az eredetinek 10%-ára nem csökken. Hozzáadunk két térfogat pirogénmentes desztillált vizet, majd az ultraszűrést addig folytatjuk, míg a térfogat 1/3-ára csökken. A műveletet további két alkalommal megismételjük. A membránon áthaladt oldatot 0,01 mólosra állítjuk be nátrium-kloriddal, majd 4 térfogat 95%-os etanollal kicsapjuk. A csapadékot háromszor etanollal (75%) mossuk, majd vákuumban szárítjuk. Az így kapott termék (Hyalastine frakció) átlagos molekulatömege 50.000-100.000. A HY kiter19 melés az eredeti friss szövetre számítva 0,4%. C. példa A Hyalectin frakció előállítása A 200.000-es kizárási határú molekulaszűrő membránján a B. példa szerinti eljárás során öszszegyűlt koncentrált oldatot vízzel addig hígítjuk, míg 5 mg/ml hialuronsav koncentrációjú oldathoz nem jutunk, glükuronsav hozzáadásával végzett mennyiség analízis alapján. Az oldatot nátriu-ldoriddal 0,1 mólosra állítjuk be, majd 4 térfogat 95%-os etanollal kicsapjuk. A csapadékot háromszor 75%-os etanollal mossuk, majd vákuumban szárítjuk. Az így kapott termék (Hyalectin frakció) átlagos molekulatömege 500.000-730.000. Ez a hialuronsav egy olyan speciális frakciójának felel meg, amelyben nagyfokú tisztaságban körülbelül 2500- 3500 szaharid egységet tartalmazó lánchosszúságú molekulák találhatók. A HY kitermelés a kiindulási friss szövetre számítva 0,2%. D. példa A hialuronsav (HY) tetrabutil-ammónium-sójának előállítása 4,02 g (10 mól-ekvivalens) HY nátrium-sót 400 ml desztillált vízben szolubilizálunk. Az oldatot ezután 15 ml szulfon-gyantát (Dovex50x8) tetrabutil-ammónium-formában tartalmazó termosztált oszlopon 4 °C-on eluáljuk. A nátrium-mentes oldatot pillanatszerűen megfagyasztjuk és fagyasztással szárítjuk. Kitermelés: 6,18 g. 1. példa A hialuronsav (HY) (részleges) propil-észterének előállítása 50% észterezett karboxilcsoport 50% sóvá alakított karboxilcsoport (Na) 12,4 g 170.000-es molekulatömegű HY tetrabutil-ammónium-sót, amely a monomer egységre számítva 20 mól-ekvivalensnek felel meg, 620 ml dimetil-szulfoxidban 25 °C-on szolubilizálunk, hozzáadunk 1,8 g (10,6 mól-ekvivalens) propil-jodidot, és a kapott oldatot 12 órán át 30 °C-on tartjuk. Hozzáadunk 62 ml vizet és 9 g nátrium-kloridot tartalmazó oldatot, és a kapott elegyet lassan, állandó keverés közben 3500 ml acetonba öntjük. A kivált csapadékot kiszűrjük, majd háromszor 500 ml 5:1 arányú aceton/víz eleggyel, majd háromszor acetonnai mossuk, végül 8 órán át 30 °C-on vákuumban szárítjuk. A terméket ezután feloldjuk 550 ml, 1% nátrium-kloridot tartalmazó vízben, és az oldatot lassan, állandó keverés közben 3000 ml acetonba öntjük. A kivált csapadékot szűrjük, kétszer 500 ml 5:1 arányú aceton/víz eleggyel. háromszor 500 ml acetonnai mossuk, végül pedig 24 órán át 30 °C-on vákuumban szárítjuk. 7,9 g cím szerinti részleges propil-észtert kapunk. Az észtercsoportok mennyiségi meghatározását R. H. Cundlif és P. M. Markunas (Anal. Chem. 22, 1028-1030 /1961/) módszerével végeztük. 2. példa A hialuronsav (HY) (részleges) izopropil-észte-20 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
