201964. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a T-limfociták érését és a makrofágok aktivitását gátló peptidek és az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
HU 201964 B xil- és/vagy amino-csoportot és/vagy hidrogénezéssel eltávolítható csoporttal észterezett vagy amidéit C-terminális karboxil-csoportot tartalmazó aminosav-származékból, illetve 1,2-diamino-etánból, ennek mono-L-valin-származékábóI vagy L-cisztindiamidból kiindulva az (l)-(20) képletű peptidek C-terminális karboxil-csoportján hidrogénezéssel vagy savas kezeléssel eltávolítható csoporttal észerezett vagy amidált, egyéb karboxil-csoportján hidrogénezéssel vagy savas kezeléssel eltávolítható csoporttal észterezett, a peptidkötésben részt nem vevő amino-csoportokon Boc- vagy Z-védőcsoportot hordozó és/vagy a hidroxil-csoporton védett származékait állítjuk elő, majd a jelenlevő védőcsoportokat katalitikus hidrogénezéssel és/vagy savas kezeléssel eltávolítjuk, és kívánt esetben a kapott (l)-(20) képletű peptideket savakkal reagáltatva savaddíciós sókká alakítjuk és/vagy a sók formájában kapott (l)-(20) képletű peptideket kívánt esetben sóikból felszabadítjuk és/vagy valamely más savval alkotott sóvá alakítjuk. Egyes esetekben a szintézis során olyan védőcsoport-kombinációt alkalmazunk, mely lehetővé teszi az amino-csoport védőcsoportjának szelektív eltávolítását, majd a szintézis végén az összes védőcsoport egy vagy két lépésben történő lehasítását. A peptidkötés kialakítására előnyösen az N-hidroxiszukcinimidészteres [Wünsch: Synthese von Peptiden, 2. kötet, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974., 149. oldal], a 168 431 számú magyar szabadalmi leírásban ismertetett pentafluor-fenilészteres, vagy a 183 579 számú magyar szabadalmi leírásban ismertetett vegyes anhidrides módszert alkalmazhatjuk. A dimer típusú (9)-(12) képletű vegyületek esetében a szintézisek kiindulási anyaga az 1,2-diamino-etán, ennek mono-L-valin-származéka vagy az L-ciszint-diamid. Ezek egy móljára számítva mintegy 2 mól acilező aminosav-származékot használunk a lépésenkénti lánchosszabbítás során (a pontos mólarány attól függ, melyik reakciópartnert célszerű feleslegben alkalmazni). Értelemszerűen a (9), a (11) és a (12) képletű vegyületek szintézisének minden egyes közti terméke szimmetrikus vegyidet, a (10) képletűé viszont aszimmetrikus. Az amino-csoportok védelmére a Boc- vagy a Z-csoportot, a karboxil-csoportok védelmére a terc-butil, a benzil- vagy a 4-nitro-benzilészter-csoportot használjuk. A fenti módon szintetizált védett pepiidről a szintézist követően eltávolítjuk az adott esetben rajta levő védőcsoportokat, majd a szabad pepiidet kívánt esetben savakkal kezelve savaddíciós sót képezünk. A védőcsoportok eltávolítására katalitikus hidrogénezést vagy savas kezelést használunk. A kapott peptidek általában gyógyászati felhasználásra alkalmas tisztaságúak, nem igényelnek további tisztítást. Szükséges esetben azonban például szilikagél tölteten oszlopkromatográfiával tisztíthatók. Az oldat formájában kapott peptideket az oldat bepárlásával vagy liofilezéssel nyerhetjük ki az oldatból. A szabad pepiidet tetszőleges sóvá alakíthatjuk. A végtermékek tisztaságát analitikai nagynyomású folyadékkromatográfiásán ellenőrizzük. 3 A célvegyületek immunrendszerre gyakorolt hatását a következő tesztekben vizsgáltuk. 1. Az ellenanyag-termelő sejtekre gyakorolt hatás újszülött patkányban Az ellenanyag-termelő sejtekre gyakorolt hatást újszülött patkányokból nyert lépsejtekkel végeztük Canningham módszere szerint (Handbook of Experimental Immunology, 2. kötet, Blackwell, Oxford-London, 1978., 285. oldal). 12 darab egy alomból származó Wistar (LATI) patkányt a születésük után 12 órán belül 7,5 |ig vizsgálandó anyaggal kezelünk intraperitoneálisan (1 mg/kg dózisban). Az állatokat 14 napos korukban 0,5 ml 1%-os birka vörösvértest-szuszpenzióval immunizáljuk intraperitoneálisan, majd az ezt követő 7. napon az állatokat dekapitációval elvéreztetjük. Az állatokból kinyert lépsejtekből birka vörösvértest-szuszpenzióval és komplementtel homogén szuszpenziót készítünk, és ezt egysejtréteg kialakítására alkalmas kamrába helyezzük. A paraffinnal lezárt kamrákat 45 percig 37 °C-on inkubáljuk. Az ellenanyagot termelő lépsejtek körül plakkok, úgynevezett litikus udvarok képződnek. A gátló anyagokkal való kezelés hatására a plakk-képző sejtek (PFC) száma csökken. Az 1. táblázatban közölt adatok ezt a csökkenést adják meg százalékban kifejezve a nem kezelt kontroll állatokból kinyert sejtekhez képest. Ugyanilyen körülmények között az immunstimuláló peptidek jelentősen növelik a plakk-képző sejtek számát. 2. Az elsődleges ellenanyag-termelésre gyakorolt hatás vizsgálata újszülött patkányban A vizsgálat az agglutináció jelenségén alapszik. Egy specifikus antisavó az antigén felszínéhez tapadva nagy granulákat képez, és ezek gyorsan leülepszenek (agglutinálódnak). Újszülött Wistar (LATI) patkányokat a születésük után 12 órán belül a vizsgálandó anyaggal kezelünk intraperitoneálisan 1 mg/kg dózissal. A 14. napon az állatokat 0,5 ml 1%-os birka vörösvértest-szuszpenzióval immunizáljuk intraperitoneálisan. Az immunizálást követő 7. napon retroorbitálisan vért veszünk, és 30 perc után a savókat ccntrifugálással leválasztjuk, majd Takátsy módszerével [Acta Microbiol.Acad.Sci.Hung., 3, 191. (1955)] meghatározzuk a hemagglutinációs titert. Két patkány összekevert savójából (50 pj) felező hígításokat készítünk 12 lépésben. Minden egyes mintához egységesen 25 pl 2%-os birka vörösvértest-szuszpenziót adunk. Az elegyet 1 órán keresztül 37 °C-on inkubáljuk az agglutináció értékeléséhez. A 2. táblázatban foglaljuk össze a kapott adatokat, melyek a nem kezelt állatokhoz képest mutatják a vegyületek elsődleges ellenanyag-termelésre gyakorolt gátló hatását százalékban kifejezve. Ebben a tesztben az immunstimuláló anyagok éppen ellentétes hatásúak. 3. A nyugvó makrofág sejtek fagocitáló képességénekgátlása Nyugvó makrofág sejtek fagocitáló képességét egéren vizsgáltuk meg [J. Immunopharmacol., 4, 265. (1982-1983)]. 22-28 g-os hím CFLP (LATI) 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
