201963. lajstromszámú szabadalom • Eljárás heterociklusos ketonok és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
HU 201963 B ás an meghatároztuk a p-nitro-anilin-képzős standard sebességét. A reakció beindítása során 2,89 ml pufferoldatot (10 mmól nátrium-foszfát és 500 mmól nátrium-klorid, pH = 7,6), 50 jUdimetilszulfoxidos szubsztrátum-oldatot és 50 pj dimetilszulfoxidot tartalmazó, 3 ml térfogatú küvettába 10 pű HLE-oldatot injektáltunk. A p-nitro-anilinképződés sebességét a reakció stacionárius állapotában grafikusan határoztuk meg úgy, hogy a kísérleti aatokat az idő függvényében felvettük, és a görbéhez a legkisebb négyzetek módszerével egyenest illesztettünk. Az így — inhibitor távollétében — meghatározott reakciósebesség-értékeket kiindulási adatként használtuk fel az inhibitor Ki-értékének meghatározásához. A találmány szerint előállított heterociklusos ketonok általában nem „lassan kötő” HLE-inhibitorok; abban az esetben azonban, ha az adott vegyidet „lassan kötő” HLE-inhibitomak bizonyult, a HLE-inhibitor hatásra jellemző Ki értékek pontos meghatározásához speciális elemzési eljárást használtunk (lásd Williams, J. W. és Morrison, J.F.: Meth. Enz. 62,437 /1979/). Egy tipikus kísérletben 2,89 ml pufferoldatot (10 mmól nátrium-foszfátot és 500 mmól nátrium-kloridot tartalmaz, pH = 7,6) 50 pil dimetil-szulfoxidos inhibitor-oldatot és 50 pd dimetil-szulfoxidos szubsztrátum-oldatot 3 ml térfogatú küvettába töltöttünk. A küvettát lezártuk, tartalmának homogenizálása céljából többször átfordítottuk, és a spektrofotométerben 25 °C-on tartottuk. 5 perc elteltével, amikor a reakcióelegy hőmérséklete már egyensúlyba jutott, a küvettába a reakció megindítása céljából 10 pj enzim-törzsoldatot injektáltunk. Zéró inhibitor-koncentráció esetén a kísérletet kétszer vagy háromszor, míg zérótól eltérő inhibitor-koncentráció esetén a kísérletet legalább háromszor ismételtük meg. A Kjértékeket Williams és Morrison fent idézett közleményében ismertetett módon határoztuk meg. Egyes vizsgált vegyületek Kj-értéke ebben a kísérletben 10-nél kisebb volt, így például az 1. példa szerint előállított vegyidet Ki értéke 3,3 x 10'10 mól. Állatkísérletek: Állatokon kísérleti úton rendszerint úgy idéznek elő emphysemát, hogy az állatoknak intratracheális úton (i.t.) elasztolitikus hatású proteázt adnak be, amely az állatok tüdejében lassan kifejlődő, roncsolásos sérüléseket okoz. A sérüléseket rendszerint a roncsoló anyag beadását követő néhány hét vagy néhány hónap elteltével értékelik. Ezek a proteázok azonban olyan sérüléseket is okoznak, amelyek már az első néhány óra elteltével észlelhetők. Ezek a korai sérülések először vérzésben nyilvánulnak meg, majd gyulladásos sérülésekké alakulnak (a gyulladás az első 24 óra végére alakul ki), és a gyulladások a proteáz beadását követő első héten normalizálódnak. A vizsgálatainkat a korai sérülések felhasználásával a következőképpen végeztük: Hörcsögöket Brevitallal enyhén érzéstelenítettünk, majd az ádatok légcsövébe foszfátpuffert tartalmazó fiziológiás sóoldatot (pH = 7,4) fecskendeztünk önmagában vagy 400 pLg humán leukocita elasztázzal együtt. 24 óra elteltével az állatokat leöltük, az állatok tüdejét kiemeltük, és a külső szö11 veteket gondosan levagdostuk. A tüdő nedves tömegét mértük, majd a tüdőt foszfátpuffert tartalmazó fiziológiás sóoldattal mostuk, és meghatároztuk a teljes kimosható vörös és fehér vérsejtek mennyiségét. A tüdő nedves tömege, valamint az összes kimosható vörösvérsejt és az összes kimosható fehérvérsejt mennyisége a HLE beadása után dózisfüggő mértékben növekedik. Az elasztáz-inhibitor hatással rendelkező vegyületek megakadályozzák vagy csökkentik az enzimmel kiváltott sérüléseket, amit az jelez, hogy a kizárólag HLE-val végzett kezeléskor észleltekhez képes csökken a tüdő nedves tömege, valamint a kimosható vörös és fehér vérsejtek mennyisége. A vegyületek aktivitásának értékelése során a vizsgálandó vegyületeket a HLE beadásával egyidőben, illetve a HLE beadását megelőzően változó időpontokban adtuk be az állatoknak. Tapasztalataink szerint a vizsgált vegyületek statisztikusan szignifikáns mértékben csökkentették a tüdő nedves tömegét, valamint a kimosható vörös és fehér vérsejtek mennyiségét. A találmány szerint előállított vegyületek a korábban ismertetett két kísérleti eljárás legalább egyikében hatásosaknak bizonyultak. Megjegyezzük, hogy nem tapasztalható mindig közvetlen összefüggés a vegyületek Ki-értéke alapján, illetve állatkísérletes úton (a nedves tüdőtömeg és a kimosható vörös és fehér vérsejtek csökkenésének mérésével) meghatározott aktivitás között. Feltételezésünk szerint az állatkísérletes vizsgálatok eredményei az in vitro vizsgálatnál jobban jellemzik a vegyületek emphysema-ellenes hatását. Az állatkísérletes vizsgálatokban akut toxicitásra utaló tüneteket nem észleltünk. A találmány szerint előállított vegyületeket melegvérűek (köztük emberek) szövetdegenerációval járó megbetegedéseinek kezelésére, elsősorban az emphysema kezelésére használhatjuk fel. A hatóanyagokat előnyösen por-aeroszol vagy folyadékaeroszol formájában juttatjuk be a kezelendő szervezetbe. Ha a hatóanyagokat poralakú aeroszolok formájában adjuk be, a készítményeket a cromolynnátriummal azonos módon, Spinhaler-típusú inhalációs készülék (a Fisons Corp., Bedford, Massachusetts, amerikai egyesült államokbeli cég gyártmánya) segítségéveljuttathatjuk a szervezetbe. Egy kapszula körülbelül 0,1-50 rag hatóanyagot tartalmazhat; a humán gyógyászatban a kezeléshez átlagosan napi 1-8 kapszulát használhatunk fel. A Spinhaler-készülékbe töltött, 20 mg töltőtömegű kapszulák a hatóanyag mellett gyógyászatiig alkalmazható hordozóanyagot, például laktózt tartalmaznak. Folyékony aeroszolos készítmények esetén a hatóanyagot „fúvásonként” körülbelül 100- 1000 pig dózisban adagolhatjuk. Ezek a készítmények a hatóanyagon kívül megfelelő hajtógázt tartalmaznak. Folyékony aeroszolokkal végzett kezelés esetén naponta 1-8 befúvást alkalmazunk. A dózis mennyisége természetesen a kezelendő rendellenesség súlyosságától, a beteg testtömegétől és az aeroszol részecskeméret-eloszlásától függően változik (kisebb méretű részecskék jobban behatolnak a tüdőbe). A folyékony aeroszolos készítmények előállításához felhasználható hajtógázokat (például fluorozott szénhidrogéneket vagy izob-12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
