201930. lajstromszámú szabadalom • Eljárás azónia-spironortropanol-észterek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
25 HU 201930 B 26 Csoportbeosztás: lehetőleg ugyanazon a napon vesszük ki a kísérlethez a kísérleti és kontrollcsoport állatait A kísérlet végrehajtása Az egy kísérlethez kiválasztott tengerimalacokat legalább 8 napig tartó szoktatási idejük után 0,1%-os acetil-ß-metil-kolin-klorid aeroszol hatásának kétszer kitesszük, mivel tapasztalat szerint az állatok az első két inhaláciÓB izgatásra erősebb légzési zavarokkal - reagálnak, mint az ezek után következőkre (adaptáció). Ha a két inhalációs fázisnál érzéketlenség (légzészavarok hiánya) mutatkozik az izgatással szemben, akkor ezeket az állatokat a tulajdonképpeni kísérletből kizárjuk. Az aeroszolos izgatás céjából a tengerimalacokat egyenként tesszük be az inhalációs kamrába, amelyben 1 perc alatt 0,5 ml oldatot mint cseppaeroszolt speciális fúvókával (Rhema, Hofheim) köddé fejlesztünk. A hatóanyag-koncentrációtól és egy esetleges előkezeléstől függően az aeroszolos izgatás többé-kevésbé kifejezett nehézlégzést idéz, elő, köhögési rohamokat és - végül - fulladást és eszméletvesztést okoz, különböző erősségű tonikus-klonikus görcsökkel. Stopperóra (Hanhart) segítségével mérjük az inhaláció kezdetétől a fulladásos állapot fellé-' péséig eltelt időt. Az állatokat az inhalációs kamrából azonnal eltávolítjuk, ezek általában a legrövidebb idő alatt helyrejönnek (öntudatra térnek és légzésük normalizálódik). He 180 mp alatt nehézlégzés nem következik be, akkor az inhalálást abbahagyjuk. A kísérleti, illetve referencia anyagok védőhatásának megállapítására a kísérleti állatokat 15 perccel az inhalálás megkezdése előtt testsúlyuknak megfelelően ezekkel az anyagokkal előkezeljük (a kontrollállatokat megfelelőképpen izotóniás nátrium-klorid-oldattal) és logaritmikusán fokozatosan változtatott acetil-ß-metil-kolin-klorid aeroszol-koncentrációknak kitesszük. Egy kísérleti napon csak egy aeroszol-koncentrációra vizsgálunk, az időköz két aeroszolos izgatás között minimum 1 hét. Analízisek és készülékek Az inhalációs kamra speciálisan erre a célra készített plexiüveg tartó, amelynek fedele gumitömitéssel és feszitő zárral légmentesen zárható. A kamra belső méretei: 285 x x 190 x 180 mm, ami körülbelül 9,75 liter térfogatának felel meg. A speciális fúvóka (rendelési szám 504104, Rhema, Hofheim cég) a fedél egy nyílásába van erősítve és a kamra térfogatát egyenletesen ellátja az aeroszollal. Az izgató oldatot egy infúziós szivattyúval (Braun, Melsungen) vezetjük 0,5 ml/perc sebességgel a fúvókához és ott 180 kPa túlnyomással egy csatlakozó nyomógázpalackból, - szintetikus tiszta levegővel köddé fejlesztjük. Az aeroszolos izgatásokat biztonsági okokból fülke alatt végezzük. Kiértékelés Valamennyi vizsgált anyagra (kísérleti, referencia, kontroll) a mindenkori vizsgált hatóanyag-koncentrációnál a nehézlégzéssel reagáló állatok százalékos arányát vesszük az ECso kiszámításánál figyelembe. Az ECso értéket, valamint az ehhez tartozó megbízhatósági intervallumot (p >95%) a súlykoefficiensekkel ellátott százalékos értékek (lásd fent) mint-regressziós egyeneseiből, az egyenes viszonyítása után, a Maximum-Likelihood módszerrel (10 iteráció) számítjuk ki. Ezenkívül az egyenesek viszonyítását a megfigyelt adatokhoz még a Chiquadrat-teszttel is vizsgáljuk. A kiértékeléshez kereskedelmi számitóprogramm (Olivetti cég) rendelkezésre áll. Megőrzés A kísérleti jegyzőkönyvek a laboratóriumban maradnak és ezeket megjelölt iratrendezőkben megőrizzük. Eredmények A troBzpium-klorid és dehidrotroszpium-klorid kísérleti vegyületek intraperitoneális beadás után kifejezett hörgógörcsoldó (broncholitikus) hatást mutatnak kolinerg indukált hörgőgörcsöknél, nem-altatott tengerimalacokon. Az aeroszollá alakítandó oldatban az acetil-ß-metil-kolin-klorid közepes hatásos koncentrációja (ECso) a kontrollállatok nál w = 0,00054 (lásd 1. táblázat). Troszpium-kloriddal, illetve dehidrotroszpium-kloriddal végzett előkezelés után a megfelelő ECso érték w = 0,00286, illetve w = 0,00173 (lásd 2. és 3. táblázat). Referenciaanyagként atropint és izoproterenolt alkalmaztunk. Atropinra, illetve izoproterenolra az izgató anyag közepes hatásos koncentrációi w = 0,00138, illetve w = 0,00145 (lásd 4. és 5. táblázat). Az 1. diagram az izgató anyag közepes hatásos koncentrációját (ECso) szemlélteti az MP 194, WG 71, atropin és izoproterenol intraperitoneális beadása után 15 perccel. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 15
