201927. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikofenolsav-/morfolino-etil/-észter és származékai, valamint e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 202 927 B 2 némi, következd módosításokkal. A monoklonális antitestet inkubálása és az ezt követő PBS-Tween- és mosási sorozat Után az NCM foltok mindegyikét 1 órán át 25 °C hőmérsékleten inkubáltuk 1:1000 hígításban (PBS-Tween-ben) levő, kecske-anti humán IgG + IgA + IgM-mel (Zymed) kapcsolt alkálikus foszfatázzal. A foltokat azután ötször öt perces mosásnak vetettük alá PBS-Tween-ben, ekkor pedig az antigénantitest kölcsönhatást láthatóvá tettük a foltokat 20-30 percig 25 °C hőmérsékleten 30 ml nitro-kék-tetrazólium/5-bróm-4-klór-3- indolil-foszfát (NBT-BCIP) szubsztrátumban inkubálva, amint ezt Leary és munkatársai leírták (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1983) 80, 4045-4049). A szín kifejlesztésének leállítására a foltot többször ionmentes vízben leöblítettük. A 13C1 és 5G2 monoklonális antitestek pozitív reakciót csak homológ antitest: bakteriális külső membrán kombináció esetében adtak. Ez azt jelenti, hogy a 13C1 monoklonális antitest csupán a Fisher- féle 5. immun-típusú baktériumok OMP-jável reagált, míg az 5G2 monoklonális antitest csupán a Fisher-féle 6. immun-típusú baktériumok OMP-jével reagált. A reakció mindkét esetben szabályos térközű csíkok létra-szerű profilját eredményezte, ami ama enged következtetni, hogy az LPS a felismert molekuláris cél. Annak alátámasztására, hogy az LPS a célzott antigén, meg kell továbbá jegyezni, hogy a létra-szerű profilok változatlanok voltak minden esetben, amikor az OMP-ket hővel kezeltük (100 °C, 1 óra), majd 60 °C hőmérsékleten 2 órán át inkubáltuk K proteináz (Boehringer, Mannheim, NSZK) jelenlétében (10-20 pg/50 pg fehérje a mintában) az elektroforézis előtt. Az utóbbi kezelésről ismert, hogy elroncsolja a fehérje-antigéneket. A 13C1 és 5G2 humán monoklonális antitestek in vitro funkcionális aktivitását vizsgáltuk meg opszonofagocitás baktericid vizsgálatban. Triptonos-szójás tápközegben nőtt, logaritmikus növekedési fázisban levő baktériumokat nyertünk ki a tenyészetből, újra szuszpendáltunk Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldatban, amely még 0,1% zselatint és 5 mmól/1 HEPES-t is tartalmazott (HBSSfGEL/HEPES), OÖ660-0,100 értékre, majd ugyanezzel a pufferral 1:1000 arányban felhígítottuk. Egészséges önkéntesek alvadt véréből származó szérum szolgált humán komplementer-forrásként. Használat előtt kilenc rész szérumot egyesítettünk 1 rész 0,1 mól/l-es EDTA-val (pH 7,2), majd adszorbeáltattuk P. aeruginosa hét Fisher-féle immun-típusával, amint ezt az I. példában részletesen leírtuk. Hogy megakadályozzuk az alternatív út komplement-komponenseinek aktiválódását, az abszorbeált szérumot tovább kezeltük zymosan- nal (Sigma) a properdin eltávolítása céljából, amint ezt Bjomson és Michael leírták [7. Inf Dis. (1974), 130. Kiegészítés, S 119- S 125]. A reakciót 1,5 wl-es, polipropilénből készült kúpos csőben úgy indítottuk meg, hogy 100 pl baktériumszuszpenziót egyesítettünk 50 pl, monoklonális antitestet tartalmazó feSftúszóval. 30 percen át szobahőmérsékleten végzett intubái ás után 50 pl komplementet, 50 pl neutrofil sejt satszpenziót és 250 pl HBSS/GEL/HEPES-t adtunk minden egyes csőhöz. A csöveket további egy órán át inkubáltuk 37 ‘C hőmérsékleten, rázógépen, ezután 10 pl-t minden csőből összekevertünk 3 ml folyékony triptonos-szójás agarral (45 "C hőmérsékleten) és a keveréket triptonos-szójás agarlemezekre öntöttük. Miután az agart megfelelő ideig szilárdulni hagytuk, a lemezre további 3 ml folyékony triptonosszójás agart rétegeztünk. A lemezeket egy éjszakán át inkubáltuk 37 °C hőmérsékleten, és a következő napon a keletkezett baktérium- telepeket megszámoltuk Quebec telepszámlálóval. Megfelelő kontrollokat is vettünk fel, hogy megvizsgáljuk az antitest fajlagosságát, valamint azt, hogy a baktericid aktivitás vajon az opszonofagocitózis eredménye volt vagy sem; a kontrollokat úgy készítettük, hogy (1) nem a megfelelő monoklonális antitestet adtuk a megfelelő antitest helyett, illetve (2) a neutrofil sejteket HBSS/GEiVHEPES-sel helyettesítettük. Amint az alábbi 5. táblázatból látható, a 13C1 és 5G2 monoklonális antitestek baktericid hatásúak voltak homológ törzseiket illetően. Az eredmények minden esetben azt jelzik, hogy az opszonizált baktériumok fagocita-felvétele a humán neutrofil sejtek által elsődlegesen felelős a baktérium-szám csökkenéséért. Ezeknek a kísérleteknek a megismétlése nem homológ antitest-baktérium kombinációkkal nem eredményezett bakteriális felvételt, így demonstrálva a fenti antitestek, mint opszonizáló antitestek mindegyikének funkcionális fajlagosságát. 5. táblázat Opszonofagocitás baktericid vizsgálat 13C1 antitest“ Neutrofil sejtekb Baktérium-telepek számac _ _ 844 + 721 + 756 + + 11 a(-)-humán anti-Fisher-féle 2. immun-típusú 6F11 monoklonális antitest b(-)-HBSS/GEL/HEPES csupán c-a kísérlet Fisher-féle 5. típusú baktériummal volt végrehajtva 5G2 antitest“ Neutrofil sejtekb Baktérium-telepek számac — 451 + 422-+ 570 + + 166 “(-)-humán anti-Fisher-féle 2. immun-típusú 6F11 monoklonális antitest b(-)-HB S S/GEL/HEPES csupán c-a kísérlet Fisher-féle 6. típusú baktériummal volt végrehajtva 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 12
