201874. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, biológiailag aktív hatóanyag, és ezt az anyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 201874 B 2 A 2. ábra mutatja a találmány szerinti eljárással előállított biológiailag aktív anyag eluciós profilját Sephadex LH-20 oszlopról, eluensként acetonitril és víz 7:3 térfogatarányú elegyét alkalmazva. A 3. ábrán a találmány szerinti eljárással előállított biológiailag aktív anyag eluciós profilját mutatjuk be, egy második Sephadex LH-20 oszlopról, eluensként metanolt alkalmazva. A 4. ábrán mutatjuk be egy, a humán cord-szérumban jelenlévő, keresztreakciót adó anyag eluciós profilját Sephasorb HP oszlopról. Az 5. ábra a találmány szerinti eljárással előállított biológiailag aktív anyag eluciós profilját mutatja Sephadex LH-20 oszlopról, gluzaláz-enzimmel végzett emésztés után, eluensként izooktán, metanol és etilacetát 4:1:1 térfogatarányú elegyét alkalmazva. A 6. ábrán mutatjuk be a találmány szerinti eljárással előállított biológiailag aktív anyag eluciós profilját Sephadex LH-20 oszlopról, eluensként metanolt alkalmazva. A 7. ábrán a találmány szerinti eljárással előállított, biológiailag aktív anyag eluciós profilja látható, amino-szénhidrát nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopról (HPLC), eluensként acetonitrilből és vízből kialakított gradienst alkalmazva. A 8. ábra a találmány szerinti eljárással előállított biológiailag aktív anyag eluciós profilját mutatja, második amino-szénhidrát HPLC oszlopról, eluensként acetonitrilből és vízből kialakított grádienst alkalmazva, az abszorpciós csúcs 210 nm-nél van. A találmány új, biológiailag aktív anyag előállítására vonatkozik, amely humán női emlőciszta-folyadékból izolálható, a digoxinnal szembei bizonyos antitestekkel immunreakciót ad, emlősöknek adagolva vérnyomáscsökkentő aktivitással rendelkezik, a pangásos szívbetegségek, szívpitvari fibrilláció és spontán ödéma kezelésére is alkalmazható. A találmány értelmében a magas vérnyomás, pangásos szívbetegségek, szívpitvari fibrilláció vagy spontán ödéma kezelésére az emlős szervezetekbe hatásos mennyiségben bevisszük a humán női emlőciszta-folyadékból izolált biológiailag hatásos anyagot. A találmány az 1-es típusú humán női emlőciszta-folyadékból izolált, biológiailag hatásos anyag tisztítására is vonatkozik. A tisztítást úgy végezzük, hogy a női emlőciszta-folyadékot rövidszénláncú alkohollal elegyítjük, majd csökkenő polaritású oldószerekkel ismételten extraháljuk. Az extraktumot ezután ismételten oszlopkromatográfiás eljárással tisztítjuk. Az új, biológiailag aktív anyagot tehát a találmány értelmében humán, női emlőciszta-folyadékból izoláljuk. Kimutatták, hogy a nők emlőjében lévő makroszkópikus méretű cisztákból származó folyadék számos biológiai fontosságú molekulát tartalmaz. A női emlőciszta-folyadékokat két csoportra lehet osztani, elektrolit-összetételük alapján. Az 1. típusú folyadékban a káliumion koncentráció magas, és a nátrium- és kloridion koncentráció alacsony. A 2. típusú folyadék jellemzője a magas nátrium és kloridion koncentráció, és alacsony káliumion koncentráció. A biológiailag aktív anyag előállítására makroszkópikus méretű emlőcisztás nőkből a ciszta-folyadékot tűvel leszívatjuk. Az izolált folyadékot -20 °C-on fagyasztva tároljuk, amíg ionösszetételét meghatározzuk. A ciszta-folyadékot felolvasztjuk, és az ionösszetételt - azaz a nátrium-, klorid- és káliumionkoncentrációt - ionszelektív elektródokkal meghatározzuk, ismert eljárásokkal. Az 1. típusú folyadékot - amelyben a kálium- és kloridion koncentráció nagyobb, mint 100 meq/i és a nátriumion koncentráció kisebb, mint 50 meq/1 - összegyűjtjük, és felhasználásig -20 °C-on tároljuk. Az ionösszetétel meghatározása után a biológiailag aktív anyagot szerves oldószerek alkalmazásával tisztítjuk. Az emlőciszta-folyadékot először rövidszénláncú alkohol, előnyösen metanol hozzáadásával frakcionáljuk, de használhatunk etanolt, izopropanolt vagy terc-butanolt is. A biológiailag aktív anyagot tartalmazó alkohol-felülúszót csökkenő polaritású szerves oldószerek egymást követő hozzáadásával tovább frakcionáljuk. Az odlószerek sorrendje acetonitril, és 1:1 térfogatarányú acetonitril-etil-acetát elegy. Az extrakciós eljárásban poláros szerves oldószerek széles skálája alkalmazható. így metil-acetátot, propil-acetátot, toluolt, és benzolt használhatunk például extrahálószerként az oldószerek közül. A biológiailag aktív anyagot ezen a ponton tárolhatjuk a további felhasználásig, vagy - előnyösen - kromatográfiás eljárással tisztíthatjuk, nyomást bíró polidextránt, például Sephasorb HP-t (Pharmacia, Piscataway, N. J., USA) és ezt követően Sephadex LH-20-at (Pharmacia, Piscataway, N. J., USA) és eluensként metanolt használva. Különösen előnyös tisztítási módszer az, mikor az 1. típusú humán női emlő ciszta-folyadékot metanollal keverjük, így a nemkívánatos komponenseket a folyadékból kicsapjuk, és a csapadékot eltávolítjuk. A felülúszót ezután acetonitrillel kezeljük, ami kicsapja a további nem-kívánatos komponenseket. A csapadék eltávolítása után a metanolt és acetonitrilt rotabepárlóval eltávolítjuk, és visszanyerjük a találmány szerinti biológiailag aktív anyagot tartalmazó első vizes fázist. Az első vizes fázist acetonitril és etil-acetát 1:1 térfogatarányú elegyével továbbextraháljuk, így egy, a biológiailag aktív anyagot tartalmazó szerves fázist kapunk. A szerves fázisból az acetonitrilt és az etil-acetátot eltávolítva egy második szerves fázist kapunk, amely biológiailag aktív anyagot tartalmazza. A második szerves fázist ezután liofilizáljuk, és a liofilizátumot metanol és víz 1:1 térfogatarányú elegyével extraháljuk. Az extraktumot ezt követően nyomást bíró polidextránnal töltött oszlopon kromatografáljuk, és biológiailag aktív anyagot tartalmazó frakciókat visszanyerjük. A biológiailag aktív anyagot tartalmazó frakciókat digoxinnal szembeli antitestekkel adott immunválaszuk alapján azonosítjuk, amelyet alább ismertetünk. A találmány szerinti eljárással előállított biológiailag aktív anyag a fenti antitesttekkel szemben immunreaktiv. A biológiailag aktív anyagot tartalmazó frakciókból ezután eltávolítjuk a metanol és víz elegyét. A kapott biológiailag aktív anyagot ebben a formában is alkalmazhatjuk, de előnyösen először Sephadex LH-20 töltetű oszlopon kromatográfiás eljárással tisztítjuk. Egy különösen előnyös megvalósítási mód szerint a tisztítást Sephasorb HP és Sephadex LH-20 oszlopokon megismételt kromatografálással végezzük. Először Sephasorb HP és Sephadex LH-20 oszlopokon kromatografálunk, az eluálást acetonitril 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
