201870. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hatóanyagként izotretinoint tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 201870 B 2 Kísérletialany Dátum Haloperidol szérumkoncent - ráció Haloperidol dózis (mg/nap) Izotretinoin dózist (mg/nap) PosBPRS 7 nap átlaga (mg/nap) 2 11/6/85 1,0 60 40 0,55 2 11/19/85 DISC 2 11/22/85 1,0 60 0 2 11/25/85 10,0 60 0 2 11/26/85 DISC 0 2 12/3/85 1,0 0 0 2 12/9/85 0 1,12 2 12/10/85 40 2 2/8/86 0 40 0,35 2 2/11/86 0 2 3/14/86 9 1,57 Az alábbi példákban izotretinoinnal (5-6. példa) 20 és tretinoinnal (7. példa) végzett állatkísérletek eredményeit ismertetjük. 5. példa „Zibic-Miller Laboratories”-től kapott nőstény 25 Sprague-Dawley nőstény patkányokat (testtömeg 380 g, standard eltérés aslO) alkalmazunk a teszt során. A HAL és OH-HAL koncentrációt elektrokémiai úton mérjük HPLC után Korpi és tsai módszerével. 30 [Korpi, E.R., B.H. Phelps, H. Granger, W. Chang, M. Linnoila, J.L. Meek és R. J. Wyatt: Simultaneous determination of haloperidol and its related metabolite in serum and plasma by isocratic liquid chromatography with electrochemical detection. Clin. Chem., 35 29, 624-628, (1983).] A koncentrációt nanogramm per milliliter mértékegységben (ng/ml), a centrifugált szérumban, vörösvérsejtekben vagy homogenizált agyszövetben határozzuk meg. Az agyminták térfogatát a fagyasztott szövetek nedves tömegéből számítjuk, 40 a kontroll állatokon mért 0,95 g/1 fajtömeg felhasználásával. Az izotretinoin („ISOT”) hatásának összszignifikaciáját a MANÓVÁ F teszt szerinti ismételt mérésekkel, két változó meghatározásával rögzítjük; ez a két változó a szövetféleség és az elvégzett teszt. 45 Az átlagok közötti különbség szignifikanciát p<0,05 mellett határozzuk meg, Tukey módszerével kiegyensúlyozatlan adatokkal. Valamennyi patkány 1 mg/kg s. c. HAL dózist kap (1% tejsavat tartalmazó fiziológiás konyhasó-ol- 50 datban; 1 ml/kg térfogatban befecskendezve). Az ISOT-ot i.p. tiszta dimetil-szulfoxidban, (lml/kg) a kívánt dózisnak (mg/kg) megfelelő koncentrációban fecskendezzük az állatokba. Az ISOT-nak a folyékony fázisban mutatott teljes mobilizációjának biztosítása 55 céljából dimetil-szulfoxidot alkalmazunk. Az összes ISOT-oldatot minden injekció-sorozathoz frissen készítjük el. Az ISOT-tal végzett összes műveletet - beleértve az injekciókat is - sárga fényben végezzük, az ISOT fotobomlásának elkerülése céljá- 60 ból. Az állatokat azonosítás céljából megjelöljük. Az injekciókat egymásután havonta egyszer fecskendezzük be; minden állat előbb haloperidolt, majd 36 perccel később izotretinoint kap. 35 állatot négy 65 csoportba sorolunk, az alábbi izotretinoin-dózisok 0 mg/kg (N-ll); 1 mg/kg (N-8); 5 mg/kg (N-8); 10 mg/kg (N=8). Öt injekció-ciklust alkalmazunk három napon keresztül, éspedig reggel 9 órakor, délután 4 órakor, reggel 9 órakor, délután 4 órakor és reggel 9 órakor kezdve. Az állatokat a harmadik napon lefejezzük; az első patkányt a harmadik napon délután 1 órakor öljük le, majd az állatokat percenként fejezzük le abban a sorrendben, ahogy az injekciót megkapták. A mag-vért összegyűjtjük, jégen lehűtjük, 20 percen át 1000 g mellett centrifugáljuk, majd a szérumot és a vörösvérsejteket elválasztjuk és a meghatározásig műanyagcsövekben -40 cC-on fagyasztjuk. A leölés után egy perccel az agyat eltávolítjuk, az agytörzstől a híd (pons) felett elválasztjuk és kb. 30 percre jégre tesszük. Az agyvelőt és rostralis agytörzset a féltekék között két részre osztjuk és -40 °C-on tároljuk. Minden állat egyik féltekéjét és a hozzácsatlakozó rostrális agytörzset lemérjük, kétszeres mennyiségű desztillált vízben homogenizáljuk, az aliquot részét eltávolítjuk és extrakció céljából a HPLC meghatározás előtt meglúgosítjuk. A HAL és OH-HAL koncentrációkat 2. táblázatban adjuk meg. A méréseket három szövetféleségen végezzük el, nevezetesen a szérumban, a vörösvérsejtekben és az agyban. Az ISOT-nak a metabolit/gyógyszer aránya kifejtett hatása vizsgálata céljából a OHHAL/HAL arányt mindhárom szövetfajtában megadjuk. így minden állaton a három szövetféleségen három meghatározást végzünk. Az ISOT dózisok kísérleti egyedek közötti összhatása szignifikáns F(3,31)—10,06, p^0,0473. A szövetféleségekre és tesztekre vonatkoztatott, kísérleti egyedeken belüli hatás egyaránt szignifikáns F(3,62)-245,41 (p-0,0001) illetve F(3,62)-396,95, p-0,0001. Az ISOT-dózis és a szövetféleségek között egyrészről valamint a teszt-típus között másrészről ugyancsak szignifikáns kölcsönhatás lép fel, F(6,62)-8,95, p-0,0001 illetve F(6,62)-9,75, p-75, p-0,0001. A szérum HAL koncentrációját szignifikánsan befolyásolja, F(3,3l)-2,96, p-0,0473. A szérum HAL áltagértékei növekvő tendenciát mutatnak, minden ISOT-dózisban emelkednek és a kontrolitól szignifikáns mértékben (p<0,05) 10 mg/kg szinten térnek el. 5
