201808. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gén amplifikáció mértékének és/vagy nukleinsav molekulák számának meghatározására és reagens készlet az eljárás megvalósítására
HU 201808 B 13 14 9. táblázat Sejt MT beütésszámx A sejtek száma a mintában beütésszámx DHFR a molekulák száma a mintában kópiaszám Kontroll sejt 253 2,3 xlO6 73 105 — Lsejtvonal 210 1,5 xlO6 233 3,8 xlO6 3 n.sejtvonal 237 2,1 xlO6 3059 8,8 xlO7 42 x A sejt-standard-, illetve teszt-nukleinsav nélkül készült kontroll kísérletek értékeinek levonása után kapott beütésszám SZABADALMI IGÉNYPONTOK 15 1. Eljárás gén amplifikáció mértékének és/vagy nukleinsav molekulák számának szendvics- vagy oldatos hibridizáció útján történő meghatározására, azzal jellemezve, hogy adott egységen belül a nukleinsav molekulák számát az ebben az egységben 20 várhatólag nagy kópiaszámban jelenlevő teszt-nukleinsav molekulák számának az ugyanezen egységen belül előnyösen konstans számban jelenlevő, megfelelően megválasztott standard nukleinsav molekulák számával történő összehasonlítása útján 25 határozzuk meg, olyan módon, hogy a) a mintában jelenlevő nukleinsavat adott esetben hibridizációs reakcióba vihető formában hozzuk és adott esetben azokat a nukleinsavakat, amelyek 30 a hibridizációs reakciót zavarhatják, olyan formába hozzuk, hogy a hibridizációs tesztben az ezekkel való interferencia kizárt legyen, b) osztatlan vagy adott esetben osztott mintában legalább egy olyan - szendvics- vagy oldatos hibri- 35 dizációra alkalmas - teszt-szondapárral hozzuk érintkezésbe, amelynek nukleinsavjai eléggé homológok a mintában várhatólag nagy kópiaszámban jelenlevő nukleinsawal, érintkeztetjük továbbá legalább egy olyan, szendvics- vagy oldatos hibrdizáci- 40 óhoz alkalmasan megválasztott standard szondapárral, amelynek nukleinsavjai eléggé homológok a mintában konstans számban jelenlevő mnukleinsav molekulákkal, és c) a hibridizációs reakció(k) lezajlása után a 45 teszt-hibridet és a standard hibridet elválasztjuk, izoláljuk és adott esetben a jelzőanyag mennyiségét megmérjük, majd az adott egységben levő nukleinsav molekulák számát a teszt nukleinsavak és a standard nukleinsavak számának összehasonlítása 50 útján meghatározzuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy teszt- és standard nukleinsavként dezoxiribonukleinsavakat alkalmazunk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez- 55 ve, hogy teszt-nukleinsavként ribonukleinsavat és standard nukleinsavként dezoxi-ribonukleinsavat alkalmazunk. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy teszt- és standard nukleinsavként ribonuk- 60 leinsavakat alkalmazunk. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy teszt-nukleinsavként dezoxi-ribonukleinsavat és standard nukleinsavként ribonukleinsavat alkalmazunk. 65 6. Az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a standard szondapár detektor szondáját - amely egy, az emberi c-Ki-rasI gén HindlII fragmentumának 1,1 kilobázis hosszúságú BglII-BglII fragmensét tartalmazó olyan rekombináns plazmid, amelyben a HindlII fragmens pBR322 plazmidba klónozottan, BglIIBglII fragmens pedig a pBR322 plazmid BamHI restrikciós enzimjére jellemző hasító helyen a pBR322-be szubklónozottan van jelen - és a befogó szondákat - amelyek az emberi c-Ki-rasI gén Hindin fragmensének 0,5 kilobázis hosszúságú BgUHindlII fragmensét tartalmazó olyan rekombináns fágok, amelyekben a HindlII fragmens pBR322 plazmidba klónozottan, a BglII-HindlII fragmens pedig az M13 mplO és M13 mpll fág vektorokba a BamHI és HindlII restrikciós enzimekre jellemző hasító helyek közé szubklónozottan van jelen -, akár egyenként, akár a teszt-szondapárral együtt, érintkezésbe hozzuk az osztatlan vagy adott esetben osztott mintákban levő nukleinsawal. 7. Az 1., 2. vagy 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a standard szodapár detektor szondáját - amely egy, az egér metallotionin gén promoter szakaszától az 5’-vég felé eső (upstream) részből származó, 1,2 kilobázis hosszúságú EcoRI-KpnI(HindIII) fragmenst tartalmazó olyan rekombináns plazmid, amelynek említett fragmense a pAT153-plazmidba az EcoRI és HindlII restrikciós enzimekre jellemző hasító helyek közé szubklónozottan van jelen -, és befogó szondáit - amelyek a metallotionon gén promoter szakaszából és az attól az 5’-vég felé (upstream) eső szakaszból származó, 0,8 kilobázis hosszúságú KpnI-BglII fragmenst tartalmazó olyan rekombináns fágok, amelyek említett fragmense az M13 mpl8 és M13 mpl9 fág vektorokba a KpnI és BamHI restrikciós enzimekkel hasítható restrikciós helyek közé szubklónozottan van jelen -, akár egyenként, akár a teszt-szondapárral együttesen, érintkezésbe hozzuk az osztatlan vagy adott esetben osztott nukleinsav-mintával. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás a c-myc onkogén amplifikációja mértékének és/vagy az ennek a génnek megfelelő hírvivő RNS molekulák számának meghatározására, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben alkalmazott teszt-szondapár detektorszondája egy, a c-myc gén 3,7 kilobázis hosszúságú HindlII-Xbal fragmensét tartalmazó olyan rekombináns plazmid, amelynek említett fragmense a pBR322 plazmidba a HindlII restrikciós enzimre jellemző hasítóhelyen szubklónozva van jelen, és 8
