201808. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gén amplifikáció mértékének és/vagy nukleinsav molekulák számának meghatározására és reagens készlet az eljárás megvalósítására
HU 201808 B valamint két jelzett reagent adunk, amelyek lehetővé teszik mind a standard-, mind a teszt-DNS meghatározását a mintákban. A tesztekben c-Ki-rasI meghatározás alapján minden esetben azonos mennyiségű DNS-t találtunk: ennek alapján a C010 320 sejtekben a c-myc gén 16-20-szoros kópiaszámban volt jelen a normális sejtekben levő génmennyiséghez képest. Az eredményeket a 2. táblázat mutatja. 2. táblázat A minta c-Ki-rasI filter c-myc filter beütésszámax beütésszámax és gének száma 7 Emberi placenta sejtek 486 340 107 Colo 320 sejtek 432 3205 l,6xl08 x A vakpróba beütésszámának levonásával kapott beütésszám 2. példa Génamplifikádó meghatározása a) Nukleinsavreagensek és ezek előállítása Standard szondák Sejt-standard nukleinsav A kontroll nukleinsavat égés metallotionin gén (MT-gén) promoter szakaszából és az attól az 5’vég irányába eső (upstream) DNS-ből vettük. Az MT-gén szerkezetét Pavlakis és Hamer ismertette [PNAS 80, 397-401 (1983)]. A referencia nukleinsav-fragmens pBPV-MMTneo432-12 vektorba klónozottan (ATCC 37224) hozzáférhető az ATCC-nél. A sejt-standard nukleinsav további kezelése A fent ismertetett MT-gént KpnI, BglII és Eco- RI restrikciós enzimekkel kezeljük pAT153 plazmidba történő szukbklónozás cljából. A KpnI hasítási véget egy linkerrel Hindin véggé alakítjuk. Standard detektor szonda AzEcoRI-KpnI-(HindIII) fragmenst, amely körülbelül l,2kilobázis hosszúságú és a metallotionin gén promoter szakaszától az 5’-vég irányában (upstream) helyezkedik el, pAT153 plazmidba klónozzuk az EcoRI és Hindin restrikciós enzimek hasítási helyei közé, majd nick-transzlációval 32P- jelzett nukleozid trifoszfáttal jelöltük. Standard befogó szonda A Kpnl-BglII fragmenst, amely 0,8 kilobázis hosszúságú és a metallotionin gén promoter szakaszát és az attól 5’-vég felé eső részt tartalmazza, M13 és mpl8 és M13 mp 19 fág vektorokban klónozzuk a KpnI és BamHI restrikciós enzimek hasítási helyei közé, majd nitrocellulóz filteren fixáljuk. Teszt szondák Teszt nukleinsav A szendvics hibridizációs módszerekhez szükséges szonda-párt a kereskedelmi forgalomban levő pMTVdhfr plazmid (Bethesda Research Laboratories, termékszám: 5369SS) felhasználásával állítjuk elő, amelynek szerkezetét Lee és munkatársai írták le [nature, 294,228-232 (1981)]. A teszt nukleinsav további kezelése A dihidrofolát-reduktáz (DHFR) gén cDNS-ét tartalmazó pMTVdhfr plazmidot HindlII és BglII restrikciós enzimekkel kezeljük. Teszt detektor szonda A HindlII-BglII restrikciós fragmenst, amely 0,75 kilobázis hosszúságú és a pMTVdhfr plazmid DHFR génjét kódoló szakasznak felel meg, a pAT153 plazmid vektorba építjük be a Hindin és BamHI restrikciós enzimek hasítási helyei közé, majd nick-transzlációval 32P-jelzett nukleozid-trifoszfáttal jelöljük. Teszt befogó szonda A pMTVdhfr plazmid MMTV génnek megfelelő részéből származó és 1,4 kilobázis hosszúságú HindlII fragmenst M13 mpl8 és M13 mpl9 fágvektorokba klónozzuk. b) A standard görbe meghatározása A tesztben használt minta egy, a pMTVdhfr plazmidból tisztítással kinyert DNS volt. Magát a tesztet az l.b) példában leírt módon folytatjuk le, azzal az eltéréssel, hogy folyadék szdntilládós számlálót alkalmaztuk. A kapott standard görbe adatait a következő 3. táblázat összegezi. 3. táblázat A mintából származó beütésszám molekulák száma/teszt DHFR filter 8 0 17 106 45 3xl06 79 107 210 c) A gének számának meghatározása A DHFR gén mRNS-ének megfelelő cDNS különböző mennyiségei hatására transzfekdón átesett sejtvonalakat sejttenyésztő tálcán növesztünk. Nátrium-dodedl-szulfáttal sejtlizist idézünk elő és a sej t-DNS-t vékony injekdós tűn való átpréseléssel vágjuk el. A homogenizátumból körülbelül 10° sejtnek megfelelő koncentrációjú 250 pl-es mintát veszünk és 50 pl nátrium-hidroxidot adunk hozzá. A mintát felforraljuk, majd ecetsavval és a hibridizációs eleggyel neutralizáljuk. Az össztérfogat 0,5 ml lett, amelyhez az összes fent leírt szondát egyidejűleg hozzáadjuk. Úgynevezett vak-filtert alkalmaztunk háttér-kontrollként. A hibridizádót, mosást és a jelzőanyag számlálását az l.b. példában leírt módon végeztük, azzal az eltéréssel, hogy folyadék szdntilládós számlálót használtunk. Az eredményeket a 4. táblázat mutatja. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
