201806. lajstromszámú szabadalom • Eljárás géntechnológiai uton módosított mikroorganizmusok által termelt tisztított növekedési hormon kinyerésére
HU 201806 B 100 jj.g/ml oldat; ez jelentős csökkenés a régebbi módszer 2 mg/ml-éhez viszonyítva. A lizozimes inkubálás megfelelő időtartama 1 és 20 óra között van. A hőmérsékletet ennek az inkubálási periódusnak a során kb. 37 °C-on előnyös tartani. Megfelelő mennyiségű alkalmas felületaktív anyagot, pl. Triton X-100-at (Rohm and Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania, Amerikai Egyesült Államok) lehet azután hozzáadni a szuszpenzióhoz kb. 1% (térf./térf.) végső koncentrációig abból a célból, hogy az olyan anyagokat, mint a sejt lipidjei, oldatba vigyük. A szuszpenziót azután tovább inkubáljuk megfelelő időn, pl. 30 percen át. A szuszpenzióban levő folyadék és szilárd anyagok alapos érintkeztetését hozzuk létre pl.megfelelő körülmények között végzett ultrahangos kezeléssel pl. 370 W-os folyamatos áramlású szonikátorral (Heat Systems Ultrasonics, Plainview, New York, Amerikai Egyesült Államok) a maximális erősség 65%-ára beállítva, 18 liter/óra - 25 liter/óra áramlási sebességgel. A kicsapódott anyagot azután elkülönítjük a szuszpenzióból, előnyösen úgy, hogy a szuszpenziót egy szilárd-hengeres folyamatos áramlású centrifugában (pl. Cepa 101-ben) megfelelő áramlási sebességet, pl. 30 liter/óra alkalmazva centrifugáljuk. Egy másik kiviteli mód szerint az elkülönítést ebben a lépésben és a következő lépésekben mikroszűréssel is kivitelezhetjük megfelelő membránnal, pl. Millipore Durapore 0,45 mikronos membránnal, centrifugálás helyett. Az elkülönítés után a pl. ultrahanggal kezelt szuszpenzióból elkülönített, kicsapott anyagot mosni lehet, megfelelő 50 mmól/liter Trisz-t vagy foszfátot (pH 7,4) és 100 mmól/liter NaCl-t tartalmazó oldattal, és újra szuszpendálni megfelelő mennyiségű alkalmas közegben, pl. pufferolt vagy nem pufferolt vizes oldatban. Az így készített szuszpenziót azután folyadékszilárd anyag érintkeztetésnek vetjük alá pl. ultrahangos kezeléssel megfelelő körülmények között, és az így nyert kicsapott anyagot részben vagy egészben elkülönítjük a pl. ultrahanggal kezelt szuszpenziót pl. a fentiek szerinti centrifugálással vagy ultraszűréssel. Az újra-szuszpendálást, a folyadék és szilárd anyagok érintkeztetést (pl. ultrahangos kezeléssel) és elkülönítését előnyösen legalább még egyszer végrehajtjuk. Egy különösen előnyös kiviteli mód szerint ezeket a lépéseket négyszer hajtjuk végre az alábbiak szerint: a létrejött csapadékot először újra szuszpendáljuk 20 mmól/liter Trisz (pH 7,4) vagy 50 mmól/liter nátriumfoszfát (pH 7,4) oldatban és a szuszpenziót folyadék-szilárd anyag érintkeztetésnek vetjük alá, pl. a fentiek szerint ultrahangos kezeléssel. Á szuszpenziót ezután a fentiek szerint centrifugáljuk, és a kinyert csapadékot újra szuszpendáljuk 50 mmól/liter nátrium-foszfát puffért (pH 7,4) és 10 mmól/liter EDTA-t és 100 mmól/liter NaCl-t tartalmazó oldatban. Ezt a szuszpenziót azután folyadék-szilárd anyag érintkeztetésnek vetjük alá pl. ultrahangos kezeléssel, és a fentiek szerint centrifugáljuk, majd a kinyert csapadékot ionmentes vízben újra szuszpendáljuk. A vizes szuszpenziót folyadék-szilárd anyag érintkeztetésnek vetjük alá, pl. ultrahangos kezeléssel és centrifugáljuk, ismét csak a fentiek szerint, és a kinyert csapadékot ismét szuszpendál-5 juk ionmentesített vízben. Ezt a második vizes szuszpenziót azután folyadék-szilárd anyag érintkeztetésnek vetjük alá, pl. ultrahangos kezeléssel és a fentiek szerint centrifugáljuk, hogy olyan csapadékot nyerjünk, amely dúsítva van a kívánt hormonban vagy analógban. Az elkülönített csapadékot oldatba visszük pl. a csapadék újra-szuszpendálásával megfelelő hőmérsékleten, pl. 4-40 ®C-on, megfelelő mennyiségű, előnyösen 25-szőrös térfogatú vízben, a pH-t megfelelő alkalikus értékre, pl. 9 és 12 közti értékre beállítva, így a hormont vagy analógját tartalmazó oldatot kapunk. Nagy nyíróerőt biztosító keverőt (pl. Politron /Kinematica/ keverő) lehet alkalmazni a feloldás megkönnyítésére. A kiindulási szuszpenzió pH-ját 9,0-12,0, előnyösen 11,8-12,0 értékre állítjuk be NaOH oldattal, pl. 1-10 n NaOH oldattal. Az NaOH oldatot előnyösen élénk keverés közben adjuk az oldathoz. Az oldatot azután egy óra hosszat inkubáljuk és keverjük, ezután a pH-t le lehet csökkenteni kb. 10,5-re. Ezután alkalmas mennyiségű, megfelelő koncentrációjú, pl. 1 mól/literes vizes nátrium-borát oldatot (megfelelő pH-ja pl. 11,5-12,0) adunk az oldathoz, hogy előnyösen kb. 10 mmól/liter végső borát-koncentrációt érjünk el. A fehérje-oldatot ezután pH 10,5-re titráljuk vagy úgy, hogy 10 mmól/literes nátrium-borát puffernd (pH 10,2) 2-10 térfogatra hígítjuk, vagy koncentrált sósavval vagy 1 n sósavval titráljuk. Az oldatot ezután tovább inkubáljuk 1-12 órán át keverés mellett. Az így nyert oldatot, ha szükséges deríthetjük az oldat ultrahangos kezelésével megfelelő körülmények között, pl. folyamatos áramlású Heat System Sonicator Model 370 berendezésben kb. 10 liter/óra áramlási sebességgel, majd az ultrahanggal kezelt oldat centrifugájával megfelelő körülmények között, pl. szilárd-hengeres folyamatos áramlású centrifugában (pl. Cepa 101-ben) kb. 30 liter/óra áramlási sebességgel, majd a felülúszó folyadék elkülönítésével és a folyadék vákuumos szűrésével Büchner vákuum-szűrőn levő Whatman 2 papíron át; ilyen módon derített oldatot állítunk elő, amely tartalmazza az oldatba vitt hormont vagy analógját. Egy másik módszer szerint kizárólag centrifugálást is lehet alkalmazni. Az oldatba vitt hormont vagy analógját azután elkülönítjük a többi sejt-alkotórésztől, pl. fehéijéktől, lipidektől és más részecskéktől, és az aggregátumokat megfelelő körülmények között végzett ultraszűréssel szétválasztjuk. Előnyösen a nyert visszamaradó anyagot legalább még egyszer ultraszűrésnek vetjük alá, így annak térfogatát kb. 95%kal csökkentjük, (vagyis 10 literről kb. 0,5 literre) a szűrletet pedig összegyűjtjük. Az ultraszűrést előnyösen Pellicon Cassette vagy PUF-100 spirál (Millipore Corp., Bedford, Massachussets, Amerikai Egyesült Államok) 100K molekulatömeg kizárásé berendezéssel végezzük. A visszamaradó anyagot előnyösen tovább hígítjuk, megfelelő pufferral alkalmas alkálikus pH-n (9 és 12 értékek között), és további ultraszűrésnek vetjük alá. Előnyösen 10 mmól/liter borát puffert (pH 10,5-12,0) alkalmazunk. Legalább még egyszer előnyös megismételni az újra hígítást és az ultraszűréssel végzett 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
