201806. lajstromszámú szabadalom • Eljárás géntechnológiai uton módosított mikroorganizmusok által termelt tisztított növekedési hormon kinyerésére
HU 201806 B A találmány tárgya eljárás tisztított eukarióta növekedési hormon vagy analógja kinyerésére transzformált baktériumsejtekből. A genetikai manipulációs kutatás egyik célja módszerek kifejletése olyan fehérjék előállítására mikroorganizmusokban, amelyeket a természetben csak magasabbrendű organizmusok termelnek. Ezt a célt már elérték bizonyos eukarióta növekedési hormonok vagy analógjaik tekintetében. Genetikailag módosított baktériumok, pl. Escherichia coli törzsek, amelyek növesztés és indukció alkalmával képesek különböző növekedési hormonokat vagy analógokat termelni, letétbe vannak helyezve az American Type Culture Collection-nál (ATCC) Rockville-ban (Maryland, Amerikai Egyesült Államok). Az ilyen hormonok alkalmazásának nagy jelentése van a mezőgazdaság területén, pl. a tej- és hústermelés növelésében a tenyésztett állatokban, valamint a gyógyászat területén, pl. a törpeségben szenvedő emberek kezelésében. A mikroorganizmusok növekeési homron-termelése a következő általános lépéseket foglalja magában: 1.) a kívánt hormon tenyésztéséhez szolgáló genetikai utasításokkal kódolt idegen DNS-be iktatása egy megfelelő mikroorganizmusba, pl. Escherichia coliba; 2.) a mikroorganizmus tenyésztése megfelelő körülmények között, (gy ezt a hormont nagy mennyiségben termeli és raktározza; és 3.) a hormon kinyerése a mikroorganizmusból és tisztítása. A hormon kinyerése és tisztítása általában magában foglalja a sejt szétroncsolását, a növekedési hormon elkülönítését más sejt-komponensektől, és a kinyert hormon továbbtisztítását. A nem kívánt celluláris alkotórészeket lehet enzimmel emészteni, felületaktív anyagokkal oldatba vinni, és a hormontól centrifugál ássál elkülöníteni. Végül a növekedési hormont különböző mértékig lehet tisztítani sokféle, a fehérjék tisztítására kidolgozott módszerekkel. Ilyen módszerek például: dializis, zónacentrifugálás, molekulakizárásos kromatográfia, izoelektromos kicsapás, besózás és kisózás, oldószeres frakcionálás, elektroforetikus módszerek, ioncserélő kromatográfia és affinitáskromatográfia. Ezek a módszerek mind a gazdaságos megvalósíthatóság mind az elérhető tisztítás mértéke szempontjából különböznek egymástól. A 4 831120 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szarvasmarha növekedési hormonhoz kinyerési és tisztítási módszerét ismerteti. E módszer szerint a hormont úgy nyerik ki, hogy az összekevert sejtszuszpenziót mechanikusan összezúzzák, és a csapadékot lizozimmal, majd dezoxiribonukleázzal inkubálják. A hormont azután úgy tisztítják, hogy az oldatot ultrahanggal kezelik, centrifugálják és a hormont tartalmazó oldatot gélkromatográfiának, ioncserélő kromatográfiának, dialízisnek és liofilezésnek vetik alá. Az itt leírt módszer nagy mennyiségű lizozimot igényel, és ismételt és időt rabló mosásokat foglal magában azért, hogy tisztított hormont termeljenek, és még így is csak viszonylag kis kitermeléssel végzik (kb. 10-15%-a a sejtben levő hormon tömegére vonatkoztatva a fermentáció végén). Ez a módszer számos hátránnyal jár a miatt, mert a de-1 zoxiribonukleázos emésztést foglal magában. A dezoxiribonukleáz drága enzim, amelyet arra használnak, hogy elemésszék a celluáris DNS-t a hormonkinyerési folyamat során. A dezoxiribonukleáz készítményről úgy találták, hogy proteázokkal van szennyezve, amelyek lebontják a kívánt temréket a kinyerés során. Á dezoxiribonukleáz alkalmazása az említett módszerben tehát csökkenti a kinyert hormon mennyiségét, hacsak további elővigyázatossági lépéseket nem teszünk bármilféle jelen levő proteáz gátlására. Ekkor sem lehetséges azonban a proteázok teljes gátlása. A termék kitermelésének csökkenésén túl a dezoxiribonukleáz alkalmazása olyan termékhez vezet, amelynek stabilitása a kívántnál kisebb a proteáz-szennyezés miatt. Új módszert fejlesztettünk ki tisztított eukarióta növekedési hormonok vagy analógjaik kinyerésére, amely könnyebben kivitelezhető, jobban szabályozható és kevésbé drága, mint a korábbi módszerek. A találmány szerinti módszerrel a kívánt termék nagyobb kitermeléssel és stabilabb formában nyerhető ki, mint amely korábban elérhető volt. A módszer csupán 2,5-5%-át igényli a korábbi módszer lizozim-mennyiségének, ezáltal megkönnyíti a tisztítást és csökkenti a kinyerés költségeit. Ezen kívül a módszer egyáltalán nem igényli dezoxiribonukleáz alkalmazását. Azontúl, hogy ez tovább csökkenti a kinyerés költségeit, a dezoxiribonukleáz alkalmazásának mellőzésével a termék kitermelése több, mint duplájára növekszik és a terméket lényegesen stabilabb formában nyerhető. Ezen kívül azáltal, hogy ez a módszer csökkent számú mosást igényel, a tisztított növekedési hormonok vagy analógok egyszerűbben, rövidebb idő alatt kinyerhetők; az időszükséglet a korábbi módszernek csupán 10- 20%-át teszi ki. Az ultraszűrést alkalmazva a módszer mind a költségek jelentős csökkenéséhez, mind a termék jobb tisztaságához vezet. A találmány tárgya tehát eljárás tisztított eukarióta növekedési hormon vagy analógja kinyerésére bakteriális sejtből, amelyben az eukarióta növekedési hormon vagy analógja termelődött a hormont vagy analógját kódoló DNS szekvencia kifejeződésének útján. A módszer a következő lépéseket foglalja magában: 1. ) a bakteriális sejt vagy sejt-fragmens sejtfalának szétzúzása lizátum előállítására; 2. ) a lizátumból a szemcséket és oldhatatlan anyagokat tartalmazó csapadék elkülönítése; 3. ) az elkülönített csapadék szuszpenziójának elkészítése megfelelő pufferoldatban; 4. ) a szuszpenzió kezelése a folyadék és a szilárd anyag közti kontaktus elérésére; 5. ) a részben vagy teljesen kicsapott anyag elkülönítése a folyadék-szilárd anyag kontaktust szolgáló szuszpenzióból; 6. ) az elkülönített csapadék oldatba vitele megfelelő mennyiségű vizes oldattal és a Ph beállítása megfelelő alkálikus pH-ra az oldat képzéséhez; 7. ) az oldatba vitt hormon vagy analógja elkülönítése más sejtkomponensektől a találmány értelmében ultraszűréssel megfelelő körülmények között, ahol az előállított szűrletet tartalmazza a hormont vagy analógját, és 8. ) az oldott hormon vagy analógja további tisz2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
