201805. lajstromszámú szabadalom • Eljárás UK-6 1689 antibiotikum mikrobiológiai uton történő előállítására valamint a hatóanyagot tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 201805 B jalisztben és más lisztekben, amint fentebb említettük. A tömény hatóanyagkeveréket közvetlenül megetethetjük a baromfiakkal, és emellett lehetővé válik, hogy az állatok a szokásos étrendjüket fogyasszák. Eljárhatunk úgy is, hogy a tömény hatóanyagkeveréket az eleséghez keverjük hozzá a kívánt mennyiségben. A keverékeket alaposan öszszekeveijük a szokásos eljárásokkal, például ikertárcsás keverővei, hogy ezzel biztosítsuk a homogenitást. Szakemberek előtt nyilvánvaló, hogy az itt leírt vegyületek koncentrációja a körülményeknek megfelelően változhat. Előnyös megelőző eljárás például, ha az állatokat a növekedési periódusban, azaz a csirkék 6-12 hetes koráig folyamatosan alacsony gyógyszerezettségen tartjuk. Fertőzöttség esetén magasabb dózis szükséges, hogy a fertőzést legyőzzük. Az eleségben a szokásos hatóanyagszint általában 15-120 ppm. Ha ivóvízben akarjuk ezt a mennyiséget beadni, figyelembe vesszük, hogy mennyi az állatok napi ivóvíz igénye és eszerint állapítjuk meg a koncentrációt. Az elmondottakat az alábbiakban példákkal szemléltetjük. A példák a találmány oltalmi körét nem korlátozzák. 1. példa a) Az oltóanyag elkészítéséhez az alábbi összetételű táptalajt állítjuk össze: 11 g/1 celeróz 10,0 kukoricakeményítő 5,0 kukoricalekvár 5,0 NZ Amine YT* 5,0 kobalt-klorid 0,002 xenzimmel emésztett kazein, Humko Sheffield Chemical Co. Inc. Miután a táptalaj kémhatását beállítottuk pH=7,0 értékre, 800 ml-t öntünk egy 2800 milliliteres Fernbach edénybe, vattadugóval és papírral lezárjuk és 60 percen át 121 °C hőmérsékleten sterilezzük 1,05 bar nyomáson. Lehűlés után a táptalajt beoltjuk az FD28454 (ATCC 53 674) törzs ferdeagar tenyészetéről készült vegetatív sejtszuszpenziójával. Az edényeket 6 napon át 28 °C hőmérsékleten rázatjuk körkörös zárógépen, melynek kitérése 3,5-7,5 cm és fordulatszáma percenként 150-200. b)800 ml tenyészettel oltjuk be a 14 literes fermentorben levő 8 liter táptalajt, mely az alábbi összetételű: g/1 cerelóz 45,0 szójaliszt 10,0 keményítőlekvár 15,0 vérliszt 5,0 kukoricaliszt 5,0 mangán-szulfát-víz 0,1 magnézium-szulfát-víz 0,1 kobalt-klorid-6 víz 0,002 kálcium-karbonát 3,0 A kémhatást 6,9-7,0 értékre állítjuk be. A 8 liter táptalajhoz hozzáadunk 4 ml szilikonos habzásgátlót. A fermentációt 30 °C hőmérsékleten végezzük, a kevertetés fordulatszáma percenként 500, a levegőztetéshez percenként a tenyészet térfogatának 0,75-ad részét kitevő levegőt használunk. Az UK- 61689 és UK-58852 antibiotikumok termelődését vékonyrétegkromatográfiával követjük nyomon. A szilikagél rétegen a kromatogram kifejlesztéséhez kloroform/metanol 9:1 arányú elegyét használjuk. A lemezeket vanillines reagenssel permetezzük le (vanillines reagens: 6 g vanillin 100 ml 3% koncentrált kénsavat tartalmazó etil-alkoholban), és 5 percen keresztül 100 °C hőmérsékleten melegítjük. Az UK-161689 antibiotikum vöröses kék foltként jelenik meg. Eljárhatunk úgy is, hogy kifejlesztett kromatogramra B.subtilis-szel beoltott agart rétegzünk, melyhez 0,4 ml 5%-os 2^,5-trifenil-2H-tetrazónium-klorid oldatoto adtunk, és 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 16 órán át. Az antibiotikumot tartalmazó hely színtelen foltként jelenik meg a vörös háttérben. A teljes fermentlevet extraháljuk metil-izobutilketonnal, majd az extraktumot bepárolva 14,4 g bepárlási maradékot kapunk. Ezt az anyagot 6x100 cm-es szilikagél G 0,07-0,2 mm szemcseméret, Woelm) oszlopon kromatografáljuk etil-acetáttal eluálva. Átfolyási sebesség ~ 20 ml percenként. 10 milliliteres frakciókat gyűjtünk. A frakciókat vékonyrétegkromatográfiával vizsgáljuk Analtech szilikagél GF rétegen, a kifejlesztéshez kloroform/metanol 9:1 elegyet használva. Az előhívás vanillinreagens be permetezéssel és melegítéssel történik. Az UK-61689 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük (össztérfogat kb. 200 ml) és 2 g Darco G60-nal kevertetjük 15 percen keresztül. A szenet szűréssel eltávolítjuk, az etil-acetátos szűrletet 5%-os nátrium-dihidrogén-foszfátos oldattal mossuk, melynek kémhatását In nátrium-hidroxiddal pH = 10,0 értékre állítottuk be. Az etil-acetátos frakciót elválasztva vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, és csökkentett nyomáson bepároljuk. A viszkózus olajként nyert bepárlási maradékot kis térfogatnyi heptánban oldjuk, melyben megindul a kristályosodás. A kristályos anyagot szűréssel elválasztjuk, csökkentett nyomáson szárítjuk, l,4gUK- 61689 antibiotikumot nyerve nátriumsó alakjában. Op.: 167 °C. C13NMR (CDCI3): 179,16,107,54,103,21,97,80, 97,01,87,02,84,65,84,28,82,39,82,10,80,92,80,28, 79,96,77,62,77,11,76,60,74,91,7^,65,73,15,70,19, 67.74.66.94.59.07.56.84.45.49.39.92.39.00. 36.55, 33,88,33,79,33,63,33,51,33,21,3251,323,30,63, 27.64.26.98.26.91.26.16.23.25.18.43.17.53.17.00, 12,13,11,05,10,47. Az UK-58852 antibiotikumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, ~2 g Darco G60-nal kevertetjük, és betöményítjük. A bepárlási maradékot hexánban szuszpendáljuk és szűrős tölcséren szilikagéllel keverjük össze. Az adszorbenst hexánnal mossuk és kloroformmal, majd etil-acetáttal eluáljuk. Az etilacetátos frakciót betöményítjük, a maradékot újra kromatografáljuk szilikagélen, és a terméket hep-12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
