201801. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pankreász-aktivitást fokozó proteolitikus komplexek és ezeket tartalmazó állattakarmányozási készítmények előállítására
HU 201801 B A találmány tárgya eljárás Streptomyces fradiae törzsből kiinduló fermentációval képzett proteolitikus komplex előállítására, ahol a fermentációban a tenyészet pH-ját a 7,0 és 7,5 közti értéken tartjuk, majd az említett komplexet valamilyen derítőszer jelenlétében szűréssel, majd speciális membránon keresztül ultraszűréssel, és végül porlasztással nyerjük ki. A találmány továbbá foglalkozik az így kapott proteolitikus komplexszel, és ennek alkalmazásaival az állattakarmányozásban, amely a komplexnek a pankreász aktivitására gyakorolt stimuláló tevékenységén alapul. A 2 034 559 lajstromszámú francia szabadalmi leírásban a szabadalmasok eljárást írnak le Streptomyces fradiae-ból kiindulva proteolitikus komplexek előállítására, valamint leírják az ilyen komplexek alkalmazását, amely elsősorban az állattakarmányozásban lehetséges. A kísérletek azt mutatták, hogy az említett szabadalom szerinti eljárást alkalmazva általában pozitív, de szabálytalan, vagy nem kielégítő eredmények kaphatók, így Uyen komplexek alkalmazása nagyon korlátozott maradt. A találmány szerinti eljárással olyan új, speciális komplexeket állítunk elő, amelyek sokkal pontosabban megállapított összetétellel bírnak, és meghatározzuk azokat a körülményeket, amelyek az új komplexek előállításához szükségesek, amely komplexek alkalmazása biztonságosan pozitív eredménnyel jár az állattakarmányozásban. Az 1133 579 lajstromszámú nagy-britanniai szabadalmi leírásban a Shinogi cég említi, hogy a Streptomyces fradiae legalább 5 proteázt, nevezetesen az la, lb, n, III és IV jelűt, valamint 2 peptidázt termelhet. A jelen találmány szerinti fermentációval kapott enzimek gyakorlatilag azonos általános tulajdonságokkal, azonos típussal rendelkeznek, mint amelyet a Shionogi cég fenti szabadalmában leírtak. így a jelen bejelentésben szereplő enzimeket ugyanazokkal a római számokkal jelöljük, mint amelyet az említett szabadalomban alkalmaztak. Megfigyeltük, hogy a proteázok 5 típusából és a peptidázok 2 típusából összetevődő teljes komplexek, melyeket a fenti szabadalomban leírtak, a bél nyálka viszkozitásának rendkívüli csökkenését idézik elő és agresszívak emésztőrendszer nyálkájára; ezért használatuk nem előnyös az állattakarmányozásban. Megállapítottuk azt is, hogy azok a komplexek, amelyek kizárólag II, III és IV típusú proteázokból tevődnek össze, a bél nyálka viszkozitásának mérsékeltebb csökkenését idézik elő, azonban kísérleteink szerint a csökkenés mértéke nem kielégítő és a kapott pozitív eredmények szabálytalanok. Úgy találtuk továbbá, hogy azok a komplexek, amelyek a II, III és IV típusú proteázt tartalmazzák, és azon belül a II típusú proteázt a III és IV típusúhoz viszonyítva túlsúlyban tartalmazzák, biztonságos és jelentős eredményt adnak. A kívánt proteolitikus komplexet a találmány értelmében úgy állítjuk elő, hogy Streptomyces fradiae törzset szerves vagy szervetlen sav adagolásával 7,5 és 7,0 közti pH-ra bállított tápközegben tenyésztünk, a proteolitikus komplexet pedig derí1 tőszer jelenlétében végzett szűréssel, majd 2000 és 12000 közti molekulatömeg tartománynak megfelelő kizárási küszöbbel bíró membránon át ultraszűréssel, végül porlasztással kinyerjük. Előnyös eljárás a tipikus WAKSMAN 3535 jelű Streptomyces törzs alkalmazása, amely az ATCC- nél ATCC10745 számon van deponálva, a tenyésztőközeg pH-jának 7,5 és 7,0 közti tartományban tartása 3 n sósavoldat segítségével, és a Millipore cég által forgalmazott P.T.G.C. nevű poliszulfontartalmú membrán alkalmazása az ultraszűréshez. Az ilyen módon előállított 3 komponensű proteolitikus komplexben a II típusú proteáz az össz-proteolitikus aktivitás legalább 450%-át, a II és III típusú proteázok a teljes aktivitás 30-30%-át képviselik. A találmány szerint előállított proteolitikus komplex jól alkalmazható az állatok, különösen nyomelem, borjak, és sertések takarmányozásában. Mivel az új komplex stimulálja a pankreász endokrin aktivitását, ennélfogva előnyösen alkalmazható vemhes és szoptatós állatok takarmányozásában is. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal részletesen szemléltetjük. Fermentáció Streptomyces fradiae törzset, pl. a tipikus WAKSMAN 3535 törzset alkalmazzuk, amely az American Type Culture Collectionnál (rövidített formában: az ATCC-nél) letétbe van helyezve 10745 számon. Ezt a törzset szabályos időközönként regeneráljuk a szilárdított tápközegeken végzett szélestés klasszikus technikájával, hogy eltávolítsuk a kis proteolitikus aktivitással rendelkező lehetséges spontán mutánsokat. Ezt a törzset az indukált mutáció klasszikus technikájával javítani is lehet a proteolitikus aktivitás fokozása céljából. Ennek a törzsnek az előtenyészeteit készítjük el, először kevert lombikban, majd köztes méretű fermentorban, amelyet azután az ipari méretű termelésre alkalmas fermentorba inokulálunk. A termelő tápközeg az alábbiakból tevődik össze: szójaliszt 15 g/1 glükóz 30 g/1 dikálium-hidrogén-foszfát 1 g/1 kalcium-karbonát 10 g/1, a pH sterilizálás után mintegy 7,0. A fermentáció hőmérsékletét 28 °C hőmérséldeten tartjuk és steril levegőt alkalmazunk 0,3 térfogat/tápközeg/perc mennyiségben. A tápközeg pH-ja, amely kezdetben közel 7,0, csökkenni kezd és eléri a 6,5 értéket a fermentáció mintegy 10. órája után; ezután a pH gyorsan növekszik és a fermentáció 20. órája után eléri a 7,5 értéket, majd folytatja a növekedést, de lassabban, így éri el végül a 8,2 értéket. Megfigyeltük, hogy nagyon fontos a pH-t 7,5 és 7,0 között tartani savas oldat, pl. 3 n sósavoldat automatikus adagolásával, ez lehetővé teszi,- hogy elkerüljük a micélium töredezését, és bizonyos szekunder metabolitok, la, Ib típusú proteázok és peptidázok kibocsátását a tápközegben. 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
