201800. lajstromszámú szabadalom • Eljárás t-PA és SCU-PA termelésének növelésére

HU 201800 B

13

14

VII. TÁBLÁZAT (folyt.)

SCU-PA termelése standard ECGF-fel és tisztított ECGF-fel különböző koncentrációknál

Tápközeg

8

24

Idő (óra)

SCU-PA (ng/üreg)

48

72

4.50 p.g/ml ECGF + 90 jtg/ml hep.

127

279

256

575

5. 50 ng/ml p-ECGF

5,6

80

90

105

6.50 ng/ml p-ECGF + 90 (ig/ml hep.

5,1

305

229

323

7.100 ng/ml p-ECGF-212

244

194

8.100 ng/ml p-ECGF + 90 p.g/ml hep.

36

258

249

541

9.200 jig/ml p-ECGF

11

258

216

238

10.200 pg/ml p-ECGF + 90 (i.g/ml hep.

289

308

730

VIII. TÁBLÁZAT

t-PA termelése standard ECGF-fel és tisztított ECGF-fel különböző koncentrációknál

Tápközeg

8

12

Idő (óra)

24

t-PA (ng/üreg)

48

72

1. RPMI egyedül

4,1

3,4

4,7

5,0

9,5

2. Hep.*

5,4

6,6

9,4

14,3

14,6

3.50 p.g/ml ECGF

4,9

7,3

27,7

27,4

27,2

4.50 jjLg/ml ECGF + hep.

8,3

15,8

51,1

102,0

149,4

5.200 ng/ml p-ECGF

5,1

8,1

26,7

17,3

13,7

6.200 ng/ml p-ECGF + hep.

6,6

11,4

37,1

76,4

79,6

7.100 ng/ml p-ECGF

5,4

6,5

14,3

12,0

11

8.100 ng/ml p-ECGF + hep.

5,7

9,1

32,6

54

41,2

9.50 ng/ml p-ECGF

4,6

5,6

8,9

7

10

10.50 ng/ml p-ECGF + hep.

5,5

5,9

20,4

25,6

22,6

11.25 ng/ml p-ECGF + hep.

5,4

6,1

13,8

17,7

16,4

13.12,5 ng/ml p-ECGF

3,4

5,1

4,4

5,4

7,7

14.12,5 ng/ml p-ECGF + hep.

4,9

3,3

9,2

14,1

12

* a heparin-koncentráció minden esetben 90 |xg/ml

Fibrin autofrágiát, I-fibrinolizist, immunprecipitálást és vizsgálatot fejlesztünk ki és alkalmazunk a t-PA és SCU-PA termelés mérésére mind kvalitativen, mind kvantitativen. Anti-UK IgG-t tisztítunk ammónium-szulfátos kicsapással és DEAE kromatográfiával humán urokináz (Abbokina- 50 se, Abbot Laboratories, Chicago, Illinois) ellen irányuló kecske antiszérumból. Az így készített anti- UK IgG-ről úgy találjuk, hogy kiváló reagens SCUPA immun kicsapásához különböző humán tüdő fibroblaszt tenyészetek felülúszóiból. Ugyanezt az 55 antitestet és egy hasonlóképpen készített nyúl anti- UK IgG-t alkalmazunk SCU-PA méréséhez kettős rétegű (szendvics) ELISA mérésben. Az I-VIII. Táblázatokban fentebb bemutatott adatokat a megfelelő ELISA vizsgálattal határozzuk meg. 60

Ezen kívül a plazminogén aktivátorokhoz (t-PA és SCU-PA) egy kromogénes mérési módszert alkalmazunk mikrotitráló lemezeken való használatra. Ebben a közvetett mérésben plazminogént alakítunk át plazminná t-PA vagy SCU-PA révén. A 65

plazmin viszont elhasítja a szubsztrátumot, a D-valil-L-leucil-L-lizin-p-nitroanilidet, felszabadítva a p-nitroanilin kromofórt, amelyet fotometriásan mérünk 405 nm-nél. Ez a vizsgálati módszer lineáris a 0,125-5,0 nemzetközi egység (IU) tartományban SCU-PA-ra és 0,5-5 ng/ml tartományban t-PA-ra. A t-PA elleni fajlagos semlegesítő antitest hozzáférhetőségével ezt a módszert lehet alkalmazni az egyes enzimek relatív mennyiségének becslésére komplex keverékekben.

További bizonyítékokat kapunk, amelyek normál humán diploid tüdő fibroblasztok által végzett SCU-PA és t-PA termelést igazolják, két technika segítségével: fibrin autográfiávalésimmunrecipitációval. Mindkét technika enzimek szétválasztásán alapul SDS-akrilamid gélelektroforézissel. Fibrin autográfia esetében az elektroforézissel elkülönítjük PA-k kimutatását úgy érjük el, hogy az akrilamid gélt felülrétegezzük fibrinagarral. Plazminogén jelenlétében plazminnal előidézett fibrinelbomlás következtében létrejött feltisztulások jelen-8