201777. lajstromszámú szabadalom • Eljárás folinsav izomerjeinek szétválasztására frakcionált kristályositás útján
HU 201777 B A találmány tárgya új eljárás N-(5-formil-(6RS)- 5,6,7,8-tetrahidrofólsav, azaz -5-CHO-(6RS)-THF vagy röviden folinsav szétválasztására, valamint N(5-formil-(6S)-5,6,7,8-tetrahidrofólsav, azaz -5- CHO-(6S)-THF vagyis a biológiailag aktív citrovorum-faktor (Leuconostoc citrovorum növekedési faktora) elkülönítésére. A folinsavnak két aszimmetrikus centruma van. Abból kifolyólag, hogy a folinsavat fólsavból, azaz N-(pteroil)-L-glutaminsavból állítják elő, a glutaminsav-csoportban lévő optikailag aktív C-atom L- formájú, míg a pteroil-csoport 5,6-helyzetű kettőskötésének hidrogénezése során keletkezett optikailag aktív, 6-os helyzetű C-atom a rácén, azaz (óRS)-formában van jelen. A szintetikus folinsav (leukovorin) tehát két diasztereomer 1:1 arányú elegye. A természetes folinsav, ahogy például a jájban előfordul, csak (6S)-formájú, azaz 5-CHO-(6S)THF.5-CHO-(6RS)-THF, és kalciumsója alakjában (leukovorin kalcium) gyógyszerként kerül felhasználásra. Megaloblasztos fólsavhiány anémia esetén adják antidótumként a fólsav-antagonisták, így aminopterin, metotrexát és fluoracil elviselhetőségének fokozására, különösen a rákterápiában (leucovorin rescue) és autoimmunbetegségek, így pszoriázis és reumás artritisz kezelésében, valamint bizonyos parazita elleni készítmények, így trimetoprim-szulfametazol elviselhetőségének fokozására a kemoterápiában. 5-CHO-(6RS)-THF adagolása után a diasztereomer-elegy (6S)-része hamar 5-Me-(6S)-THF-vá alakul, míg a (6R)-része nem vesz részt az anyagcserében és a vizelettel lassan kiválasztódik [J. A. Straw et al., Cancer Research 44,3119 (1984)]. F.M. Sirotnak et al. [Biochemical Pharmacology28, 2993-97, (1979)] azt találták, hogy L 1210 szövetkultúrákban a metotrexát okozta sejtnövekedési gátlás elnyomásához használva a folinsav [5- CHO-(6R)-THF] 100-szor kevésbé, a kémiai-szintetikus diasztereomer-elegy [5-CHO-(6RS)-TH] kétszer kevésbé hatásos, mint a természetes diasztereomer [5-CHO-(6S)-THF], A fenti, in vitro meghatározott értékeket C. Temple és mktsai [Cancer Treatment Report 65, 1117-9 (1981)] in vivo vizsgálatokkal is megerősítették; azt találták, hogy a metotrexát toxicitásának visszaszorításában a természetes diasztereomer több, mint kétszer olyan hatásos, mint a diasztereomerek elegye (a leukovorin). A szerzők a nem természetes diasztereomereknek még valami káros hatását is tulajdonítottak. Az 6-CHO-(6R)-THF ugyanis a Ci-transzferért felelős enzimek között néhányt gátolja, és ezzel a tetrahidrofolátok biokémiai hatását csökkenti [R.P.Leary et al., Biochem. Biophys. Rés. Commun. 56,484 (1973); V. F. Scott et al., ugyanott 14, 523 (1964); TG.K. Smith et al., Biochemistry, 20, 4034 (1981)]. A (6RS)-tetrahidrofolátok (6R)-tetrahidrofolátokkal történő kiváltásának a kétszeres hatáserősség mellett minőségi terápiás előnyökkel is kellene, hogy járjon. Igény mutatkozott tehát a diasztereomerek eddig alkalmazott 1:1 elegyének a természetes hatóanyaggal [5-CHO-(6S)-THF] történő helyettesítésére. 1 Az 5-CHO-(6RS)-THF szétválasztását, illetve az 5-CHO-(6S)-THF aszimmetrikus szintézisét többször megkísérelték. A szétválasztást például az 5-CHO-(6RS)-THF egyik alkáliföldfémsójának, így a kalcium- vagy stronciumsójának vizes oldatból történő frakcionált átkristályosításával próbálták megoldani [D. Cosulich et al., J. Amer. Chem. Soc. 101. 6114 (1979)]. A. D. Cosulich által leírt körülmények között azonban szétválasztás nem végezhető el. Ha például az 5-CHO-(6RS)-THF kalciumsóját 7-8 pH mellett vizes oldatból kristályosítják, mindig újból kapják a 6RS-formát, ahogy a fajlagos optikai forgatás, valamint királis HPLC-oszlopon végzett kromatográfiás vizsgálat alapján kimutatható. Lényegtelen, hogy az 5-CHO-(6RS)-THF kalciumsója nyers vagy tisztított; mindig a 6RS-forma marad. A 6S-forma feldúsulása és elválasztása akkor sem érhető el, ha az 5-CHO-(6RS)-THF túltelített vizes oldatát a valódi 5-CHO-(6S)-THF- alkáliföldfémsójával oltjuk. A diasztereomer-párokat kromatográfiásan is próbálták szétválasztani [J. Feeney et al., Biochemistry 2Ű, 1837, (1981)]. A (6S)-izomereket dihidrofolátok dihidrofolát-reduktáz jelenlétében végzett sztereospecifikus redukálása útján is nyerték [L. Rees et al., Tetrahedron 42.117,1986]. L. Rees et al. [J. Chem. Soc. Commun. 1987. ill. 0.266.042. sz. alatt publikált európai szabadalmi bejelentés] (6RS)-THF számára olyan szétválasztási eljárást írtak le, amelynek segítségével kis mennyiségű 5-CHO-(6S)-THF és 5-CHO-(6R)THF nyerhető. Az eljárás szerint (6RS)-THF-t ()-klórhangyasav-metilészterrel reagáltatnak a diasztereomer 5-(-)-mentil-oxikarbonil-tetrahidrofólsavakká, ezeket butanollal végzett ismételt kezeléssel szétválasztják, a kapott diasztereomereket telített hidrogénbromid-oldat, hangyasav-oldat és ecetsav elegyében felmelegítik, miközben hidrolízis következtében 5-formil-(6S)- és (6R)-THF keletkezik, és ezeket kalciumsóik alakjában izolálják. Az eljárás körülményes és nehézkes; a királis ágens előállításához az igen mérgező hatású foszgén szükséges. A kiindulási anyag, a (6RS)-THF nagyon bomlékony anyag. A királis segédcsoport hidrogénbromiddal ecetsavban 50 °C alatti hőmérsékleten végzett lehasítása során a glutaminsav egy része is lehasad, nehezen elválasztható melléktermékek keletkezése közben. Az eljárással előállított (6S)-fólsav olyan drága lenne, hogy az (6RS)-tetrahidrofolátok helyettesítésére bizonyára nem alkalmaznák. A (6S)-tetrahidrofolátok előállítására tehát a mai napig sem találtak használható eljárást. A találmány feladata olyan eljárás kifejlesztése volt, amellyel 5-CHO-(6S)-tHF egyszerű módon, ipari mértékben is előállítható. Meglepő módon azt találtuk, hogy a (6RS)-folinsav [6-0-(6S)-THF] sóinak a vizes oldatából szerves vagy szervetlen savak vízben oldódó alkálifém-, ammónium- vagy alkáliföldfémsóinak az adagolására a megfelelő folinát csapódik ki, amely túlnyomó részben a nem természetes diasztereomer (6R)-folinátból [5-CHO-(6R)-THF] áll. A csapadék szűréssel elválasztható. A túlnyomó részben a kivált természetes (6S)-folinátot tartalmazó szűr2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
