201775. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferon tisztítására
HU 201775 B don, s így egy GIF-termelő, transzformált Escherichia coh törzset kapunk, jele W3110/pIN5T4N143. A tisztítási eljárás minden ábrán úgy kezdődik, hogy eltávolítjuk a nukleinsavakat a homogenizált, gamma interferont tartalmazó sejtek centrifugálás után kapott felülúszójából. A megelőző lépéseket az érthetőség kedvéért mutatjuk be, de ezek nem tartoznak a találmány oltalmi körébe. Bár a példákban leírt tisztítási eljárásban cinkklorid szerepel cink sóként, azonban a találmány nem korlátozódik ennek a sónak a használatára. Más cink sók, mint a cink-szulfát és cink-acetát és réz sók, mint például a réz-szulfát, szintén előnyösen használhatók. Az I. táblázatban a különböző fémsó vegyületek proteáz gátló hatását mutatjuk be. A hatást úgy vizsgáljuk, hogy a rekombináns baktériumsejteket 1 mmól vagy 0,2 mmól illető fémvegyületet tartalmazó puffer oldatban feltárjuk és a hatás indikátoraként a felülúszó folyadékban lévő h-INF-y aktivitású polipeptid stabilitását mérjük. Mint ahogy az I. táblázatból kitűnik, azt találtuk, hogy a cink-szulfát, cink-acetát, cink-acetil-acetonát és a réz-szulfát ugyanolyan hatást eredményez, mint a cink-klorid. I. táblázat Proteázos bomlást gátló hatás vizsgálata polipeptiden Zn, Cu és más fémsók hozzáadása után 9 Fém só Bomlást gátló hatás polipeptiden 1 mmól 0,2 mmól Fém só nélkül — _ Cink-klorid + — Cink-szulfát + _ Cink-acetát + — Cink-acetil-acetonát + — Cink-szalicilát ± — Réz-szulfát + + + Vas-szulfát — — Kobalt-klorid — — Ammónium-molibdát ±+bomlást gátló hatása van "nincs bomlást gátló hatása Az 5. ábra (foto) egy SDS-PAGE képet ábrázol, amely a h-INF-7 aktivitású polipeptid stabilitását mutatja be (a protein sávot a GIF146-tal jelzett nyíl mutatja). A vizsgálandó mintákat úgy készítjük, hogy a sejteket különböző koncentrációjú cink-kloridot tartalmazó megfelelő pufferben roncsoljuk. Az 5. ábrából látható, hogy a h-INF-7 aktivitású polipeptid 0,5-2 mmól cink-klorid jelenlétében stabil, ennél alacsonyabb koncentráció mellett, vagy cink-klorid nélkül, hajlamos a bomlásra. A „B” nyíllal jelölt protein sáv a GIF14Ő tisztítása során a proteázos bomlást szenvedett polipeptidet mutatja. A 2-1 jelű mintát a fent leírt módon készítettük 2 mmól cink-kloriddal és ezután tisztítottuk. A 2-2 jelű mintánál cink-kloridos kezelést nem végeztünk, csak tisztítottunk. Egy hasonló kísérlet eredményeit, amelyben a cink-klorid helyett réz-szulfátot használtunk, a 6. ábrán mutatunk be (foto). Ebben az esetben a kívánt eredményeket a 0,1- 4 mmól közti koncentrációknál kaptuk. Bár ezek a sók a nagyobb koncentrációknál adják a megfelelő proteáz gátlást, mégis előnyösebb olyan alacsony koncentrációban használni e sókat, amennyire csak lehetséges, mivel a tisztítás során el kell ezeket távolítani. Előnyös, ha a cink-kloridot 1-3 mmól koncentráció határok közt és a réz-szulfátot 0,26- 1 mmól közt használjuk. A 7. ábrához (foto) a minta ugyanúgy készült, ahogy az 5. ábrához, de GIF143-termelő baktériumok kezelésével. Az ábrán a GIF143 feliratú nyűlal jelölt protein sáv a h-INF-7 aktivitású polipeptidet mutatja és „E” egy olyan polipeptidet ábrázol, amely a GIF143 részleges proteázos bomlásakor keletkezett. A roncsolt sejt/gamma interferon keverékben lévő szennyezések közül legfontosabbak a kisméretű részecskék és a vízoldható frakciók, ilyenek a nukleinsavak, proteázok, sejtfehérjék, szénhidrátok, lipidek, lehasadt interferon fragmentumok, interferon aggregátumok és más olyan fragmentumok, amelyek az interferon termelő sejtek felbomlása következtében keletkeznek. Kidolgoztuk azt a módszert, amivel a gamma interferont elő lehet állítani nagy tisztaságban, biológiai aktivitásának megtartása mellett és jó kitermeléssel. Eszerint az interferon tartalmú keverék feldolgozását az alant leírt speciális sorrendben végezzük annak érdekében, hogy az interferon degradációja minimálisra csökkenjen és az interferon tartalmú keverékből a szennyezések eltávolítását meghatározott rendben végezzük el. Lényegesen nagyobb tisztaságot és aktivitást kapunk, ha az interferont tartalmazó keverékből a szennyezéseket a következő sorrendben távolítjuk el: 1) nukleinsavak; 2) negatív töltésű proteázok és szennyezett sejt proteinek; 3) pozitív töltésű proteázok és szennyező sejt proteinek; 4) hasadt és aggregálódott interferon. A lépéseknek ez a sorrendje meghatározó abból a szempontból, hogy a találmány által megkívánt eredményeket kapjuk meg. Amennyiben a felsorolt szennyezéseket a meghatározott sorrendben távolítjuk el, kiegészítő lépéseket is használhatunk a többi szennyező anyag—például a nagy molekulatömegű hidrofób anyagok—eltávolítására, ha ilyenek jelen lennének. Ezeket az anyagokat a 3. vagy a 4. lépés után kényelmesen eltávolíthatjuk. Számtalan módszer ismert ezen a szakterületen, amelyekkel minden egyes ilyen elválasztást el lehet végezni. Ahogy fent megállapítottuk, azok a módszerek a legmegfelelőbbek, amelyekkel az interferon degradációjának minimálisra való csökkentése érdekében a legkíméletesebben lehet az elválasztásokat keresztülvinni. Úgy találtuk, hogy igen kedvező módszer, ha egy kezdeti kicsapást végzünk polietilén-iminnel, amelyet a szennyezések eltávolítása céljából, számos kromatográfiás elválasztási módszer követ, a fent meghatározott sorrendben. A kromatográfiás elvá10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
