201775. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferon tisztítására
HU 201775 B sejtekből vagy rekombináns mikroorganizmusokból kivont és tisztított polipeptidekre vonatkozik (161321/1984. számú japán közrebocsátási irat, 4.476.049. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás stb.). Azonban igen nehéz a kívánt polipeptidet biztosan renaturálni, még az esetben is, ha a denaturáló szert eltávolították. Ezért, ha az előállítandó polipeptidet gyógyszerként használják fel, ez a módszer nem előnyös, ugyanis ha a gyógyszer részlegesen denaturált polipeptiddel van keverve, akkor antigénné válhat. Másrészt, ha a tisztítási módszerben monoklonális antitestet használnak (előzőleg közlésre került a 186995/1984. számú közrebocsátási iratban stb.) fel lehet tételezni, hogy egy denaturált polipeptid dimer és trimer formája hozzákapcsolódhat a monoklonális antitesthez, az alkalmazott monoklonális antitest által felismert antigén determinánstól függően. A fent említett amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban egy olyan módszert ismertetnek, amely rekombináns Escherichia coli-ban termelt h-IFN-y kivonására vonatkozik proteáz inhibitor jelenlétében azért, hogy meggátolják a polipeptid proteáz hatására bekövetkező bomlását, de az eljárásban használt guanidin-hidrokloridról tudjuk, hogy szintén protein denaturáló szer (lásd például a 161321/1984. számú japán közrebocsátási iratot). Ennélfogva várható, hogy bár meggátolható a polipeptid proteáz általi bomlása, mégis előfordul, hogy az előállítás eredménye denaturált protein lesz. Kívánatos lenne tehát egy olyan tisztítási eljárás kidolgozása, amellyel 1) gamma interferont el lehet különíteni a gamma interferont termelő feltárt sejtek sejtmaradványaitól; 2) amellyel a gamma interferont nagy kitermeléssel, nagy tisztaság és aktivitás mellett el lehet választani a sejtszennyezésektől; 3) amellyel a rekombináns gamma interferont el lehet választani a sejtből származó szennyezésektől; és 4) amellyel lényegében az interferon degradáció nélkül választható el a sejtből származó szennyező anyagoktól. Az alábbiakban leírt tisztítási eljárás egy ilyen módszert foglal magába. A jelen találmány szerinti hatékony tisztítási módszer egy lényegében tiszta, és a kívánt fiziológiai aktivitással rendelkező polipeptidet eredményez. E módszerrel meggátolható a polipeptid proteáz hatásra történő bomlása és elkerülhető a polipeptid denaturálódása. Ezenfelül, bár a jelen találmány a h-IFN-y aktivitású polipeptid tisztítására vonatkozik, a jelen találmány szerinti módszer nemcsak a h-IFN-y, hanem más olyan polipeptidek kivonására és tisztítására is felhasználható, amelyeknek proteáz bontásra érzékeny csoportjaik vannak, mint az Arg-Lys és Ag-Arg és amelyeket rekombináns mikroorganizmusok termelnek. A jelen találmány szerint úgy oldjuk meg a fenj leírt problémákat, hQgy a kivonási lépésbep egy vagy több cink- vagy réz-sót és polictilén-imint (PEI) adagolunk. Még részletesebben, a találmányban foglalt eljárás szerint a rekombináns mikroorganizmus sejt-tenyészetét egy olyan puffer oldatban szuszpendáljuk, amely egy vagy több cink- vagy réz-sót tartalmaz, a sejteket feltárjuk, majd PEI-t adunk a centrifugált felülúszóhoz, amelyet ezután 3 megfelelő tisztítási eljárásnak vetünk alá. Cink- vagy réz-só gyanánt számos vegyület használható, ezek közé tartozik a cink-klorid, cink-szulfát, cink-acetát, cink-acetil-acetonát és réz-szulfát, de a cink-klorid, cink-acetát és réz-szulfát a legelőnyösebb. A sókoncentrációk optimuma különböző a peptid termelő törzstől függően, de a cink sók esetében általában 0,5-5 mmól közt van, még előnyösebben 1-3 mmól között és a réz sók esetében 0,01-3 mmól között, még előnyösebben 0,25- 1 mmól között. Ezeket a sókat a fenti koncentrációkban bekeverjük egy puffer oldatba, a sejt tenyészetet a kapott oldatban szuszpendáljuk, majd a sejteket feltárjuk és centrifugálással kapjuk a felülúszót. A felülúszóhoz PEI-t adunk 0,5-1,1% végső koncentrációig. A PEI hozzáadására a szennyező proteinek tekintélyes része is kicsapódik. A PEI hozzáadása után a felülúszót állni hagyjuk alacsony hőmérsékleten, például 4 cC-on. Centrifugálás után a csapadékot eltávolítjuk, majd a kívánt anyagot szokványos módszerekkel tisztítjuk. A tisztítást könnyen elvégezhetjük, ha számos oszlop- és dializáló módszert kombinálunk. Bizonyos esetekben a kisózásos módszert is beiktathatjuk az eljárásba. A speciális kisózásos módszert is beiktathatjuk az eljárásba. A speciális kiviteli módot a példákban alább ismertetjük. A jelen bejelentést megelőzően már közlésre került, hogy IFN-ß termelésnél egy cink sót adnak a táptalajhoz a kitermelés növelése érdekében (146597/1984. számú japán közrebocsátási irat). Azonban a leírás szerint itt arra törekedtek, hogy a tenyésztés alatt a titer növekedjék és nincs arról szó, hogy az extrakciós lépésben a sót PEI-vel együtt adják, mint a jelen találmányban. A tisztítási eljárásnál réz vegyületnek a használatára vonatkozik például egy réz-kelát gyanta oszlop alkalmazása, amely a 167597/1984. számú japán közrebocsátási iratban szerepel, ámbár ez a találmány egy előzőleg tisztított IFN oldat tisztítási módszerére vonatkozott. A megelőző közlemények, mint a fent említett találmányok is, lényegükben különböznek a jelen találmánytól, amelyet az jellemez, hogy az extrakciós lépésben szerepel a sók adagolása abból a célból, hogy a tisztítás ne okozza a protein denaturálódását vagy lebomlását. A jelen találmány egy másik tárgya egy h-IFN-y aktivitású, alapjában véve tiszta polipeptid izolálása, amely a jelen találmány szerinti tisztítási és kivonási módszerrel állítható elő. A W3110/pIN5T4 egyike a h-IFN-y aktivitású polipeptid termelésére képes törzseknek. Az E.coli W3110/pIN5T4 a 0234673. számú európai közrebocsátási iratban leírtak szerint az ATCC 27325. számon szereplő E. coli W3110-nek a pIN5T4 plazmiddal végzett transzformálásával állítható elő. A pIN5T4 plazmidot (amelyet a 0134673. számú európai közrebocsátási irat 7. ábrája mutat be) a pIN5GIF54 plazmidban egy ampicillin rezisztencia gén (ÄP*) tetracikiin rezisztencia génnel (Te1) való helyettesítésével állítják elő. A pIN56IF54 plazmid a pINI-A2 és a p61F54 plazmidokból pIN46IF54- en keresztül állítható elő a 0134673. számú európai közrebocsátási irat szerint. A pINI-A2 PERM BP- 320 számon, a P6F54, amely lényegében azonos a 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
