201680. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorgátló hatású szinergetikus gyógyszerkészítmény előállítására
11 HU 201 680 A 12 erősségű nekrózist okozott A kontroll csoportban 3 állat közül egynél sem találtunk nekrózist, a kontroll állatoknak azonos mennyiségű, DEAE-oszlopon frakcionált RPMI1640 táptalajt injektáltűnk. A fentiek értelmében a hTNF mind az in vitro, mind az in vivo TNF meghatározásra szolgáló vizsgálatban aktívnak bizonyult A hTNF molekulatömege - akár FCS-t tartalmazó, akár FCS nélküli táptalajon nyertük - közelítőleg 70 000 dalton, Sephacryl S-200 oszlopon végzett meghatározás szerint 12 órát meghaladó savas vagy lúgos kezelés hatására a hTNF aktivitása csökken, például pH 2,0-nél az aktivitás 90%-a, pH 4,0-nél 55%-a, pH 10-nél közel 45%-a megsemmisül. Hőstabilitást tekintve a hTNF aktivitása 70 *C-on 60 perces kezelés hatására megsemmisül, míg 56 ‘C-on 60 perces kezelés után megmarad. Az aktivitás még huzamos ideig tartó -78 *C-os vagy -20 *C-os raktározás után is megmarad. A PMA-val serkentett LuklI sejtek frakcionálatlan felülúszójában 100 egység/ml IFN-aktivitást találtunk. A DEAE-kromatográfiás eljárással tisztított hTNF összegyűjtött frakcióiban nem találtunk interferon-aktivitást, sem a használt tisztított egér TNF-ben. A humán interferon aktivitást a hólyagos stomatis vírus WISH vagy GM 2767 sejtek elleni hatásának gátlásával mértük [Stewart W. E. II: The Interferon System, 1979 (Springer, Vienna)], és a rekombináns humán alfa-IFN (Hoffman-La Roche) esetén nemzetközi standarddal, humán természetes gamma-IFN esetén pedig laboratóriumi standarddal hasonlítottuk össze. A 2-4 x 10® egység/mg protein aktivitású rekombináns alfa-hIFN-t a Hoffman- La Roche-tól kaptuk, a leukocita eredetű természetes alfa-hIFN-t (aktivitása 0,64 x 106 egység/mg protein) a Kocher Laboratory (Bem, Svájc) állította elő, a Sloan- Kettering Institute értékelési programja keretében, az 1 x 107 egység/mg protein specifikus aktivitású természetes béta-hIFN-t a Roswell Park Memorial Institutetól (RPMI) kaptuk, míg az 1 x 107 egység/mg protein specifikus aktivitású leukocita eredetű természetes gamma-hIFN dr. Berish Rubin-tói (Sloan-Kettering Institute) származott. Sem az egér, sem a humán TNF nem rendelkezett részlegesen tisztított állapotban kimutatható mértékű IFN-aktivitással. A különféle humán interferonok sem rendelkeztek kimutatható hTNF-aktivitással, mivel a fentebb ismertetett in vitro vizsgálatban nem mutattak citotoxikus vagy citosztatikus hatást érzékeny L-sejtekkel szemben. Mint a 3. táblázat adataiból látható, az előállított hTNF különböző sejtekkel szemben különböző hatást fejt ki. Citotoxikus hatásról csak akkor beszélünk, ha az élő sejtszám 7 nap múlva 35%-kal, vagy annál nagyobb mértékben csökken, míg citosztatikus hatás esetén a sejtszám csökkenése 7 nap múlva 35%, vagy annál nagyobb. Ebben a vizsgálatban - és a leírásban ismertetett több vizsgálatban is - a fentebb leírt módon LuklI sejtekkel termelt hTNF-et használunk. Az adott példákkal azonban csak ismertetni kívánjuk a találmány szerinti megoldást, nem korlátozni. Más B-sejtvonalakból származó hTNF, vagy más humán sejtekből előállított TNF is használható in vivo és in vitro a különféle humán sejtekkel végzett vizsgálatokban. A 3. és 4. táblázatban közölt adatokból látható, hogy a hTNF az egér TNF-hez hasonló hatást fejt ki a humán emlő-sejtvonalakra, mivel mindkettő citotoxikus hatású a vizsgált emlőrák eredetű sejtvonalak többségére. A tüdő- és melanoma-sejtekre is hat a hTNF, a hatás azonban főleg citosztatikus. A vizsgált négy normál sejtvonal - tüdő-, vese-, magzati tüdő- és magzati bőr-sejtvonal - közül egy sem volt érzékeny a hTNF-fel szemben: Ennek alapján úgy tűnik, hogy a hTNF csak tumoros humán sejteken fenti ki citotoxikus, citosztatikus vagy vérzéses nekrózist okozó hatását A hTNF humán célsejtekkel szembeni specifikus aktivitása nagyobb, mint az egér TNF-é. A humán interferonok - mind az alfa-, béta- és gamma-interferon -, tekintet nélkül arra, hogy természetes eredetű vagy rekombináns interferonról van szó, ismert módon gátolják a tumoros sejtek növekedését, például az 5., 6. és 9. táblázatban közölt tumor-sejtvonalak esetén. Általában a 35%-os vagy annál nagyobb citotoxikus vagy citosztatikus hatás eléréséhez szükséges vírusellenes IFN-egységek száma alfa-IFN esetén nagyobb, mint béta-IFN vagy gamma-IFN esetén. Az IFN-készítmények közül egy sem fejt ki citotoxikus vagy citosztatikus hatást L(S) egér-sejtekre in vitro, amiből a hTNF-áktivitás hiányára következtethetünk. Mégis, ha ezt a két sejtek által termelt anyagot megtisztítjuk, és együtt alkalmazzuk, a mérhető hatás nagyobb, mint a külön-külön mutatott hatás összege, amint az a 7. és 8. táblázatban ismertetett példákból is látható. Az IFN és hTNF együttes citotoxikus hatása Clarke [Ann. N. Y. Acad. Sei. 76, 915 (1985)] módszere szerint meghatározva is szinergetikusnak, azaz farmakológiailag szinergetikusnak bizonyult, a 10., 11. és 12. táblázat eredményei szerint Ez az előre nem várt eredmény nagyon értékes lehet a humán tumorok kezelése szempontjából. 3. táblázat hTNF hatása humán sejtvonalakra Citotoxikus hatás: SK-MG-4 (asztrocitoma) MCF-7 (emlőrák) BT-20 (emlőrák) SK-BR-3 (nyakrák) SK-CO-1 (vastagbél-rák) RPMI 7931 (melanoma) Citosztatikus hatás: SK-LU-1 (tüdőrák) RPMI 4445 (melanoma) SK-MEL-29 (melanoma) SK-MEL-109 (melanoma) SK-OV-3 (petefészek-rák) Hatástalan: T-24 (hólyagrák) 5637 (hólyagrák) MDA-MB-361 (emlőrák) S-48 (vastagbél-rák) SK-LC-4 (tüdőrák) SK-LC-6 (tüdőrák) SK-LC-12 (tüdőrák) SK-MEL-19 (melanoma) SK-UT-1 (méhrak) SAOS-2 (ösztrogén szarkóma) U20S (ösztrogén szarkóma) WI-38 (normál magzati tüdő) MY (normál vese-hám) F-136-35-56 (normál magzati tüdő) F-136-35-56 (normál magzati bőr) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
