201679. lajstromszámú szabadalom • Eljárás retrovirus-fertőzések elleni szinergista hatású gyógyászati készítmények előállítására
9 HU 201 679 B 10 koncentrációtól függően pusztítja el a vírussal fertőzött sejteket. Az elért hatás kisebb mértékű egyedül tumornekrózis alfa-faktor használata esetén. Figyelembe véve, hogy a tumomekrózis faktor, illetve az interferonnal alkotott kombinációja védőhatást fejt ki a vírusfertőzésmentes sejtekre, a 2. táblázat igazolja, hogy a találmány szerinti készítmény kedvező hatású a retrovirus okozta fertőzések kezelésénél. 3. példa A HÍV vírus replikációjának csökkentése tumomekrózis faktorral és interferonnal HuT78 sejteket 0,1 pg/ml tumomekrózis alfa-faktorral és 0,1 pg/ml gamma-interferonnal kezelünk, majd megfertőzzük őket HÍV vírussal az 1. példában leírt módon. 37 *C-on 2 napig végzett inkubálás után az összes ribonukleinsavat kivonjuk a HÍV vírussal megfertőzött sejtekből az alábbiak szerint A sejteket PBS- sel mossuk, majd 0,35 ml TSM pufferoldatban szuszpendáljuk 0 ‘C körüli hőmérsékleten. A használt TSM pufferoldat 10 mM íriszből, pH = 7,5,0,15 M nátriumkloridból és 2 mM magnézium-kloridból állt, és emellett 0,5% NP-40-et és 17 pl VRC-t (BRL) is tartalmazott. 3-5 perc elteltével a sejtmagokat centrifugálással elválasztjuk a feltárt sejtektől. Az mRNS-t tartalmazó felülúszó folyadékot 0,35 ml TSE pufferoldathoz (10 mM trisz, pH = 7,5, 0,15 M nátriumklorid és 5 mM EDTE) adjuk, amely 1% SDS-t is tartalmaz, és 3 x 0,7 ml fcnol(kloroform)izoamilalkohol 24 : 24:1 arányú eleggyel extraháljuk. A fenolt egyensúlyba hozzuk vízzel és 0,1% 8-hidroxi-kinolinnal. A vizes fázisból kicsapjuk a ribonukleinsavat etanol és nátriumacetát segítségével. Ezután poli(A) RNS-t készítettünk oligo(dT) cellulóz elektioforézissel [Aviv, H. és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 69, 1408-1412 (1972)]. Northem-hibridizációt végeztünk 1-1 sorban 1 pg RNS felhasználásával a szakirodalomban leírt módon [Thomas, R, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 77,5201- 5205 (1980)]. Az 1. ábrán bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a tumomekrózis alfa-faktorral történő előkezelés elnyomja a HÍV RNS megjelenését a gazdasejtekben, és lényegesen kevesebb RNS jelenik meg, amikor tumomekrózis faktort és interferont együttesen alkalmazunk. Ezek az eredmények megfelelnek a fertőzőképességgel kapcsolatos, az 1. táblázatban feltüntetett adatoknak. Nem figyelhető meg változás az aktin mRNS-tartalomban (ez egy szerkezeti fehérje), akár végzünk kezelést tumomekrózis faktorral és interferonnal, akár nem. Ez arra mutat, hogy a tumomekrózis alfa-faktor és az interferon hatása inkább a vírust, mint általában a sejtnövekedést célozza meg. 4 4. példa AIDS-ben vagy ARC-ben szenvedő betegek gyógyításának jegyzőkönyve A vizsgálatba olyan férfiakat vonunk be, akiknek a vérsavója pozitív a HÍV antitestre, és a vérük in vitro sejttenyészete pozitív kimutatható HÍV titemél. Ezeknél a betegeknél általában az AIDS-nek vagy az ARC- nek megfelelő tünetek jelennek meg, és szerológiai átalakulás történik HÍV antitest esetén. A kezelésbe bevont személyeket csoportokra osztjuk a következő kezelési változók alapján: 1. Kezelés egyidejűleg vagy egymást követően tumomekrózis faktorral és interferonnal. 2. Intravénás vagy intramuszkuláris befecskendezés, és intravénás befecskendezés esetén kezelés bolusszal vagy folyamatos bevitel infúzióval (1,2,5 és 10 nap). 3. A kiindulási dózis 1 pg/m2 tumomekrózis faktor és 1 pg/m2 interferon, majd mindegyik hatóanyag dózisát 5, 10, 25, 50... pg/m2 értékre növeljük a beteg szervezet toleranciája szerint 4. A tumomekrózis faktor és az interferon egymáshoz viszonyított aránya: 1:100 -100:1. 5. Egy-öt alkalommal megismételjük a kezelési ciklusokat, miközben 1,2,5 vagy 10 napra felfüggesztjük a kezelést 6. Az egyes alkalmazott interferontípusok és arányuk: alfa-interferon és gamma-interferon 1: 10 - 10: 1 arányban; béta-interferon és gamma-interferon 1:10 - 10: 1 arányban; gamma-interferon, alfa-interferon vagy béta-interferon egyedül 1:1:1 — 10:1:1 — 1: 5 : 5 arányban. A célszerű kezdeti kezelés abból áll, hogy az ARC- ben szenvedő betegeket a tumomekrózis alfa-faktor, gama-interferon és alfa-interferon kombinációjával kezeljük. Ezt a kombinációt folyamatos infúzióval adjuk be olyan intravénás infúziós szivattyú segítségével, amely a kalibrálás szerint 1-10 pg/m2 tumomekrózis alfa-faktort, 1-10 pg/m2 gamma-interferont és 1- 10 pg/m2 alfa-interferont továbbít 24 óra alatt A betegek nagyobb dózisokat is kaphatnak, ha nem jelentkezik tolerancia probléma. Ezt az infúziós kezelést egy hétig végezzük. Hagyjuk, hogy a következő héten a betegek pihenjenek, majd az infúziós kezelést megismételjük. A mellékhatásokat, például a lázat, hidegrázást stb. A szokásos módon kezeljük, vagy csökkentjük a dózist. Ha a fenti hatóanyagok mellett vírusellenes szerként anti-HIV antitestet vagy gpl20 env-t is beadunk, az antitestet vagy az env polipeptidet olyan dózisban alkalmazzuk, hogy megkösse azokat a virionokat, amelyeket a találmány szerinti kombinációs készítménnyel végzett kezelés felszabadít Ez a dózis függ az antitestnek a virionnal szembeni affinitásától és a semlegesítő titerétől, valamint a beteg vírustiterétől. A célszerű dózis meghatározását a gyakorlott szakember könnyen elvégezheti. A kezelés alatt és utána ellenőrizzük a betegek állapotát és vírusfertőzési titerét. Az 1-3. példában ismertetett in vitro vizsgálatoknak megfelelően a kezelés eredményeként javult a betegek statisztikailag szignifikáns hányadának az immunállapota és a vírustitere. / 5. példa A kataláz potencírozza a gamma-interferon és/vagy a tumomekrózis alfa-faktor vírusellenes aktivitását 96 bemélyedést tartalmazó, laposaljú tálcákban (gyártó: Falcon Plastics) elhelyezett táptalajra A549 sejteket oltunk bemélyedésenként 2x10* mennyiségben, 24 órával a vizsgálandó mintákkal történő inkubálás előtt. A vizsgált mintákat a 2. ábrán tüntetjük fel, ahol „CAT” jelentése kataláz (gyártó: ICN Biochemicals, Ohio, USA) IFN jelentése interferon, TNF jelentése tumomekrózis faktor. A minták egyébként Dulbecco által módosított Eagle-féle táptalajt tartalmaznak (DME), amelyet 5% mennyiségű, hőkezeléssel inaktivált magzati borjúszérummal (FCS), 2 mM glutaminnal, 100 egység/ml penicillinnel és 100 pg/ml sztrepto-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
