201678. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán retrovírus elleni 3'-azido-3'-dezoxitimidin-származékokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
9 HU 201 678 B 10 5. példa 3’ -azido-3' -dezoxitimidin 5’-monofoszfátjának előállítása 0,5 g 3 ’-azido-3 ’-dezoxitimidint (1,87 mmól) 5 ml trietil-foszfátban oldunk, és az oldatot -5 ’C hőmérsékletre hűtjük. Erős keverés közben egyszerre 0,685 ml foszfor-oxi-kloridot (7 mmól) adunk hozzá, majd az oldatot 22 óra hosszat -10 *C hőmérsékleten tartjuk. A reakcióclcgyből mintát veszünk, melyhez tömény ammónium-hidroxidot adunk. Vékonyrétegkromatográfia (cellulóz, n-propanol: víz 7:3) a kiindulási anyag maradékát nem mutatja, egyetlen fluoreszkáló folt, Rf érték alacsonyabb, mint a nukleozidé. A reakcióelegyet 20 ml jeges vízre öntjük, majd jeges fürdőbe tesszük, és az elegy pH-ját 2n nátrium-hidroxiddal 7,5 értékre beállítjuk. A bázikus clegyet egyszer kloroformmal és egyszer vízzel extraháljuk. A vizes fázist ismét 7,5 pH- ra beállítjuk és a szerves oldószer maradékát vákuumban eltávolítjuk. Az anyagot a következőkben leírt tisztításig -10 °C hőmérsékleten tartjuk. Dezaktivált szén készítéséhez 100 g kókuszdiószenet (50-200 mesh) 500 ml In sósavval, 3 liter vízzel, 15 ml 3% toluolt tartalmazó 95%-os etanollal, 600 ml 85%-os metanollal és végül bőségesen vízzel mossuk. A dezaktivált szenet (12 ml ülepített nedves szén) keverés közben hozzáadjuk a monofoszfát oldalhoz (0,72 g, 1,1 mmol, 30 ml). A felső folyadékot dekantáljuk és a szenet 150 ml vízzel mossuk. A szénről a nukleotidot 120 ml 1,5 mól ammónium-hidroxid 50%-os etanolos oldatával mosva, eluáljuk. Az oldatot 0,22 mikronos szűrőn szűrjük, vákuumban 10 ml-re betöményítjük, Amicon Centriflo CF-25 membránon szűrjük és liofilizáljuk. A diammónium-3’-azido-3’-dezoxitimidin-5’-monofoszfátot mint szilárd anyagot kapjuk. A vegyületet nuklcozid 5’-monofoszfálként írjuk az 5’-nukleotidáz azon képességével, hogy ez nukleoziddá bontható. 6. példa 3’ -azido-5'-trifoszfát-3’ -dezoxitimidin és 3’-azido-5' - -difoszfát-3-dezoxitimidin a) bisz( tri-n-butil-ammónium)-prifoszfát A DOW 50 (Dowcx ioncserélő gyanta, DOW Chemical Laboratories) piridinium-gyanta oszlopot úgy készítjük, hogy 40 ml gyantát egy 25 cm átmérójű oszlopra öntjük és vízzel addig mossuk, míg a mosóvíz színtelen nem lesz. Pirofoszfát-dekahidrátot (1,12 g, 2,51 mmól) 30 ml vízben oldjuk, és az oszlopra öntjük. Az oszlopot vízzel eluáljuk és 125 ml frakciót, mely UV-abszorbeáló anyagot tartalmaz, egyesítjük. Az oldatot vákuumban 10 ml-re betöményítjük és 1,2 ml tri-n-butil-amint adunk hozzá. Az elegyet vákuumban betöményítjük, és a maradékot négyszer piridinnel bepárolva szárítjuk. A terméket -5 *C hőmérsékleten hűtőben tároljuk. b) 3’ -azido-5’ -monofoszfát-3' -dezoxitimidin hidrogén formája A monofoszfát hidrogén formáját az 5. példában kapott 0,1 g ammóniumsó (0,283 mmól) 6 ml vízben való oldásával, és az oldat 1,5 ml (10 ekv.) DOW 50 H+ oszlopon történő átcrcsztésévcl állítjuk elő. c) 3‘ -azido-3’-dezoxitimidinfoszfor-morfolidát származéka A b) műveletben kapott monofoszfát 0,283 mmól hidrogén formáját 9 ml vízben oldjuk, 99 pl morfolint (1,13 mmól, 4 ekv.) adunk hozzá, és az oldatot visszafolyatás közben melegítjük. 0,234 g diciklohcxil-karbodiimidet (1,13 mmól, 4 ekv.) 5 ml tcrc-butanolban oldunk, melyet 3 óra alatt beadagolunk. A reakcióelegyet egy éjjelen át visszafolyatás közben melegítjük, majd szobahőmérsékletre hűtjük, szűrjük, és az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A maradékhoz ctanolt adunk és vákuumban négyszer bepároljuk. A maradékot metanolban oldjuk, és a foszfor-morfolidátot éter hozzáadásával kicsapjuk. A csapadékot négyszer éterrel eldolgozzuk, és forgó bepárlóban szárítjuk. A címben megadott vegyületet kapjuk. d) 3' -azido-3'-dezoxitimidin-5'-trifoszfát A c) műveletben kapott foszfor-morfolidát származékot négyszer piridin eltávolításával vákuumban szárítjuk. Az a) műveletben kapott bisz(tri-n-butil-ammónium)-pirofoszfátot szintén piridin eltávolításával vákuumban szárítjuk. A foszfor-morfolidátot 5 ml piridinben oldjuk, és a pirofoszfát reagenst tartalmazó lombikba öntjük. A reakciót egy éjjelen át szobahőmérsékleten hagyjuk végbemenni. A piridint ezután vákuumban eltávolítjuk, a maradékhoz vizet adunk és vákuumban háromszor eltávolítjuk. A maradékot fagyasztjuk. A maradékot felolvasztjuk és 50 ml vízben oldjuk. Az oldatot egy 50 ml ammónium-hidrogén-karbonát-oldattal kezelt DEAE Scphadex A-25 oszlopra (1x10 cm) öntjük. A foszfátot 300 ml 50-800 mM lineárisan növekvő koncentrációjú ammónium-hidrogén-karbonát-oldattal eluáljuk. A difoszfát-nuklcotidot, valamint a trifoszfát-nukleotidot tartalmazó frakciókat külön-külön összegyűjtjük, majd a difoszfát és a trifoszfát frakciók mindegyikét vákuumban szárítjuk, vízben ismét oldjuk és szárítjuk, majd végül vízben újból oldjuk és liofilizáljuk. 7. példa 3'-azido-5’-trifoszfát-3’-dezoxitimidin enzimatikus szintézise Az 5’-trifoszfátot 5’-difoszfálból piruvát-kináz és nukleozidádifoszfát-kináz alkalmazásával szintetizáljuk. A reakcióclegy 6 mM 3’-azido-TDP-t, 12 nM adenozin-trifoszfátot, 40 mM magnézium-kloridot, 40 mM kálium-pipcrazin-N,N-bisz(2-etánszulfonsav)-at, PIPES fupper (pH 6,8), 30 mM foszfocnolpiruvátot, 40 IU/ml nuklcozid-difoszfát-kinázt és 100 IU/ml pirufát-kinázt tartalmaz 5 ml végső térfogatban. A reakcióelegyet 37 °C hőmérsékleten 5 napig inkubáíjuk, majd egy ammónium-hidrogén-karbonáttal kezelt DEAE Sephadex A-25 oszlopra (2,5x10 cm) öntjük. A nukleotidokat 100-1000 mM növekvő koncentrációjú ammónium-hidrogén-karbonát-oldaltal eluáljuk. A trifoszfátot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és vákuumban szárazra bcpároljuk. A vegyületet preparatív HPLC oszlop (Whatman Inc., Magnum 9 SAX) alkalmazásával tovább tisztítjuk és 10-100 mM növekvő koncentrációjú kálium-foszfát-oldaltal (pH 3,5) eluáljuk. A kapott vegyületet az előbbi DEAE Scphadex A-25 oszlop alkalmazásával tovább tisztítjuk. A tctraammónium-3’-azido-3’-dczoxitimidin-5’-trifoszfátot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, vákuumban szárítjuk, vízben újból oldjuk és liofilizáljuk, úgy a címben megadott vegyületet kapjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
