201671. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiai rendszerekben lévő prosztaglandinok és hidroxi-zsírsavak szintéziséhez szükséges telítetlen zsírsavakat tartalmazó hatóanyag keverék és gyógyszerkészítmények előállítására
9 HU 201 671 B 10 B teszi a vízben nem oldódó anyagoba 0,125 ml telítetlen zsírsavat (arachidonsav, 5,8,ll,14,17,eikozapcntaénsav, 8,11,14-eikózatriénsav, Fa. Sigma München) 0,05 ml etanolban vagy dimetil-szulfoxidban oldunk. Ehhez 0,2 ml etanolt, illetve dimetil-szulfoxidot adunk, amely 2 mg stabilizátort tartalmaz és tartalmazhat még 2 mg stimulátort (lásd 1. táblázat), azonnal elveszünk 0,1 ml-t, extraháljuk és analizáljuk. A további kezelés az 1. vagy 2. változat szerint történik. 1. változat oldatoba 24 óra hosszat 37 "C-on inkubáljuk, majd ismét 0,1 ml-t elveszünk belőle, 0,1 ml vízzel összekeverjük, extraháljuk és analizáljuk. 2. változat szilárd ele gyekre A maradék oldatot megszabadítjuk az oldószertől, 24 óra hosszat inkubáljuk 37 'C-on, majd ismét oldjuk 0,15 ml oldószerben, 0,1 ml-t elveszünk, 0,1 ml vízzel összekeverjük, extraháljuk és analizáljuk. Extrakció és analízis A kapott mintákat 0,05 ml 1,2 mólos vizes citromsavoldattal elegyítjük, kétszer extraháljuk 0,5 ml acetil-acctáttal, az acetil-acelálot az összeöntött extraktumokból eltávolítjuk és a maradékot 0,8 ml metanolban oldjuk és nagynyomású folyadékkromatográfiásán analizáljuk (Rad Pak C-18 100 x 8 mm-es oszlop, Firma Waters, Königstein, NSZK, 1,5 ml/perc, futtatószer 800 ml metanol, 200 ml víz, 0,1 ml jégecet). Az elválasztást kereskedelmi forgalomban lévő UV detektorral végezzük 206 mm-nél. 2. módszer: Prosztaglandinszintézis 0,3 ml 0,03 mól kálium-foszfát puffer (pH = 8) 0. 5 mg enzimet (birkaondóhólyagocskák formájában) [Biochemistry 10 (1971) 2372] vagy belső vesevelő homogenizátumot [Life Sciences 26 (1980) 765], 2,75 |ig 14-C-arachidonsavat (0,5 (iCi) és 0,5 mg stimulátort és adott esetben 0,5 mg 1. táblázat szerinti stabilizator anyagot tartalmaz. 10 percig inkubáljuk 37 "C-on, az inkubálás után 0,05 ml 1,2 mólos citromsavat adunk hozzá, és kétszer extraháljuk 0,5 ml acetil-acetáttal, az összeöntött extraktumokból az oldószert eltávolítjuk, a maradékot feloldjuk 0,2 ml metanolban, 1: 1 arányban vízzel hígítjuk és nagynyomású folyadékkromatográfiásán elválasztjuk (Nukleozil C-18, 125 x 4,6 mm-es oszlop, Firma Bischoff, Leonberg, NSZK, futtatószer 300 ml acetonitril, 700 ml víz, 1 ml jégecet, 30 perc tiszta metanol után). A rádioaktív frakció elválasztását monitorral figyeljük (LB 504 Fa. Berthold, Wilbad, NSZK). A képződött termékeket, mint például a 6-keto-prosztglandin-F,.if.-t. a prosztaglandin Ert, prosztaglandin-Fjjifc-t, prosztaglandin D2-t ilyen feltételek mellett választjuk szét. 1. táblázat A prosztaglandin képződés fokozása stabilizált zsírsav készítményekben A prosztaglandin PGE2-t, PGF^.-t és PGD2-t az arachidonsav termékeiként a 2. módszer segítségével analizáljuk és összprosztaglandinként az összeget 100%-ra vonatkoztatjuk. A stimulátor hozzáadás nélkül keletkezett mennyiségű összprosztaglandin felel meg f = 1-nek, és a stimulálás után keletkezett mennyiséget erre vonatkoztatjuk, f = 2 vagy f = 3 kétszeres vagy háromszoros stimulálást jelent a 2. módszer szerinti körülmények között A minta stabilitását az 1. módszerrel vizsgáltuk (jobb oldali oszlop). Adalék hozzáadása nélkül (jobb oldali oszlop: A) ilyen feltételek mellett vizes oldatban az arachidonsav 25-28%-a marad meg. A 25-28-nál magasabb értékek tehát stabilizálást és a 25-28%-nál alacsonyabb értékek destabilizálást jelentenek. Az 1. példát stimulálás nélkül hajtottuk végre. A találmány szerinti hatásokat a megfelelően jelzett példák szerinti stabilizált készítményekkel érjük el. A stabilizálás vonatkozásában vizsgált anyagok (a mennyiségeket tekintve lásd az 1. módszert) a következők voltak: A) vizes oldat stabilizátor nélkül, B) etanolos oldat további adalékok nélkül, C) piridonoldat, D) rutinnal dimetil-szulfoxiddal előre feloldva majd a dimctil-szulfoxidot leszivatva, E) megfelel a B) pontnak lecitinnel etanol leszivatva, F) mint A) lószívből kapott citochrom (Fa. Boehringer, Mannheim, NSZK), G) mint A) methemoglobinnal (humán) (Fa. Sigma, München,NSZK), H) mint A) szarvasmarhából kapott szérumalbuminnal (Fa. Calbiochem, Frankfurt, NSZK), J) mint A) vagy B) de oldószer nélkül, K) mint J) citochrom, L) mint J) humán hemoglobinnal (Fa. Behringweike, Marburg, NSZK), M) mint J) humán szérumalbuminnal (Fa. Bchringwerke, Marburg, NSZK). A találmány szerinti stabil készítmények beleértve a gyógyászati készítményeket is. 68-70. példa Steril körülmények között 50 mg nálrium-arachidonátot 500 mg szarvasmarha szérumalbumint és 500 mg L-tirozint 10 ml kétszeresen desztillált vízben oldunk és szintén steril körülmények között egy barna üvegben tartunk. 93,5% eredetileg meglévőarachidonsavat 6 hétig tárolunk szobahőmérsékleten, majd ismét elővesszük és ezalatt az ugyanilyen nátrium-arachidonsav oldat adalékok nélkül gyakorlatilag egyáltalán nem tartalmaz már arachidonsavat (arachidonsav tartalom 0,8%-nál kisebb). Az ily módon előállított stabilizált oldatot 68. példa gyógyászati célra egy ívampullába töltjük, 69. példa 15 mg birkaondóhólyagocskával elegyítjük, 60 percig 37 "C-on inkubáljuk és az így keletkezett prosztaglandint extraháljuk és a 2. módszer szerint kikészítjük, vagy 70. példa a páciensek trombózisra való hajlamának klinikai-biokémiai meghatározását alkalmazzuk oly módon, hogy 0,01 ml stabilizált nátrium-arachidonál oldatot elegyítünk 1 ml lizált trombocitában dús vérplazmával, melyet ettől a pácienstől vettünk, és-30 percig inkubáljuk 25 "C-on majd extraháljuk. A képződött prosztaglandin D2- t (2. módszer) a páciens trombózisra való hajlamának értékeként használjuk. 71. példa 100 mg 5,8,11,14,17-eikózapentaénsavat és 500 mg nitint 15 ml dimetil-szulfoxidban oldunk és a dimclil-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
