201657. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rovarirtó hatóanyag előállítására Bacillus thuringiensis var. kurstaki fermentálásával
1 HU 201 657 B 2 A találmány növényi kártevőkre, különösen lombrágó hernyókra szelektíven letális hatású baktérium cndotoxin-tartalmú hatóanyag előállítására vonatkozik Bacillus thuringiensis var. kurstaki fermentálásával. A hatóanyagot toxikus metabolit stabil termelésére szelektált Bacillus thuringiensis var. kurstaki törzzsel állítjuk elő fermentációs úton. Az eljárás szerint előállított termék biológiai növényvédőszer hatóanyaga, amely alkalmas különféle növénykultúrákban a lombrágó kártevők megsemmisítésére. A kapott termék lé, sűrítmény vagy porított készítmény formájában közveűenül felhasználható, vagy a szokásos segédanyagokkal keverhető a növényvédelmi cél és alkalmazástechnológia igénye szerint. Ismeretesek azok a törekvések, amelyek az agrobiocönózis hasznos tagjait kímélő gazdaságos, komplex növényvédelmi technológiák kialakítását és bevezetését tervezik. Ezek olyan eljárások, amelyek a következő ismérvekkel jellemezhetők (Darvas B., Seprős, I., Szántó J.: Biológiai védekezés. MÉM NAK., Bp. 1979. 53. pp.):- kombinált védekezési műveleteket alkalmaznak (agrotechnikai, fizikai, kémiai, biológiai),- a pcszticid terhelést mennyiségében és minőségében csökkentik (pest management system),- a kártevők leküzdésében a természetes flóra és fauna elemeket is használják (integrált növényvédelmi technológiák). Az általánosan használt kemikáliákkal szemben a következő két lényeges kifogás emelhető:- nem szelektívek, pusztítják a biocönózis hasznos tagjait is,- idővel rezisztens típusokat szelektálnak. A Bacillus thuringiensis inszekticid aktivitását Ishiwata (1901) fedezte fel. [Ishiwata, S.: 1901. On kind of severe flacherie (sotto disease), (I.) Dainikon Sanshi Keiho, 9: 1-5.]. Az első részletes leírást Berliner E. (1911) adta olyan B. thuringiensis tenyészetről, amelyet az Ephestia kühniella Zell, beteg lárváiból izolált. (Berliner E.: 1911. Über die Schlaffsucht der Mehlmattenrauge. Z. Gesante Getreidewes. 252: 3160-62.). Entomotoxikus laboratóriumi készítményt Metalnyikov (1930) próbált meg először gyakorlatban alkalmazni (cit: Misusztyin E. N„ Emcev V. T.: 1978. Mikrobiológia. Kolosz. Moszkva. 313-314.). A biológiai védekezésnek a kezdeti szerény eredmények alapján nem jósoltak átütő sikert (Padlót 1933. cit.: Yamvrias C.: 1962. A Bacillus thuringiensis Berliner hatása lisztmoly hernyókra. Entomophaga, Tom. VII. No. 2., 2. n. é. 101-159.). Az USA-ban Dulry (1940) próbálkozott mérsékelt eredménnyel entomopatogéneket felhasználni növényi kártevők ellen (Cit.: Yamvrias 1962). Európában ezen a téren a Pasteur Intézetben végeztek jelentős fejlesztő munkát (Lcmoignc és Bonncfoi, 1957. cit.: Yamvrias 1962.). 1961-ben már számos országban forgalmaztak B. thuringiensis készítményeket. A kezdeti alkalmazást sok kudarc kísérte. így például a „Sporein” készítmény Anagasta lárvák ellen 1,7 tömeg%-os koncentrációban sem volt eredményes (Krieg 1961. cit.: Yamvrias, 1962.). A B. thuringiensis patogén hatásspektrumát Hcmpcl- Angus vizsgálta (1956,1959, cit.: Yamvrias, 1962.). A biológiai értékmérésscl Yamvrias idézett monográfiája foglalkozik részletesen. Burges és szerzőtársai (1981) igen részletes tanulmányban foglalták össze mintegy 10 év alapkutatási és fejlesztési eredményeit. [Burges H. D. (cd.), Microbiol control of pests and plant diseases 1970-1980. Acad. Press. Inc. (London), Ltd. London, 1981.]. Az entomocid metabolitok termelésével és applikációjával kapcsolatos műszaki ismeretek röviden a következőkben foglalhatók össze Darvas et al.: 1979, Burges 1981, Misusztyin-Emcev 1986, Whiteley-Sdínapf: 1986. Ann. Rev. Microbiol. 1986. 40: 459-75., V. V. Szmimov et al.: 1986. Aerob spóraképző baktériumok. Medicina. Bp. 205. p. munkái alapján. A kristályos entomocid metabolitot (toxin kristályt) termelő bacillusok meglehetősen elterjedtek a természetben. A toxint termelő törzseket igen eltérő taxonómiai csoportokba tartozó rovarok elpusztult fejlődési alakjaiból lehet izolálni, de talajban is fellelhetők (Russel S. etal.: 1987. Selective proccs forEfficicnt Isolation of soil Bacillus sp. Appl. and Envir. Microbiol. Jan 1263-1266.). A B. thuringiensisnek - vélemény eltérésekkel - 17 szubspccicsc (varietása) ismert. Ezek többségükben megfelelnek a H antigén alapján meghatározott szerotípusnak. A fontosabbak a következők: HD szerotípus (Uoward-Dulmage gyűjtemény) 1 B.thuringiensis var. thuringiensis HD-120,290 2 B.ihuringiensis var. finitimus 3 a B.thuringiensis var. alcsti 3 a,b B.thuringiensis var. kurstaki (Kurstak, 1962) 3 a,b B.thuringiensis var. kurstaki HD-1 4 a,b B.thuringiensis var. sotto 4 a,b B.thuringiensis var. dcndrolimus 4 a,c B.thuringiensis var. kenyae 5 a,b B.thuringiensis var. galériáé HD-8 5 a,c B.ihuringiensis var. canadicnsis 6 a B.thuringiensis var. subtoxieus 6 a,b B.thuringiensis var. cntomocidus HD-9 7 B.thuringiensis var. aizawai 8 B.thuringiensis var. morrisoni 9 B.thuringiensis var. tolworthi HD-13 10 B.thuringiensis var. darmstadiensis HD-498 11 a,b B.thuringiensis var. toumanoffi 12 B.thuringiensis var. tompsoni HD-542 14 B.thuringiensis var. israclcnsis HD-567 21 B.thuringiensis var. colmeri $ 0 B.thuringiensis var. wuhancnsis Az egyes szerotípusok cnzimaklivitás spektrumban is eltérhetnek egymástól, ennek fermentációs ipari jelentősége lehet (pl. keményítő bontás, szacharóz fermentálás). A kristályos zárványok fehérje természetűek. A B. thuringiensis fehérje kristályai szcrotípustól függetlenül 18 aminósavat tartalmaznak, főleg glutamin- és aszparaginsavat. Utóbbi miatt a kristály fehérjék izoclcktromos pontja alacsony. Cisztin tartalom alapján diszulfid kötések jelenléte valószínű. A fehérje kristályok oldódnak 0,1 N NaOH-ban, 8 M guanidin-kloridban, 8 M karbamidban, lúgos tioglikolátban. A fehérje kristályok afcrmcntációs bontása során nagy molckulatömegű (>800 000 dalion) és kis molckulalömegű (>10 000 dalton) fragmensek képződnek, a nagy molckulatömegűek toxikusuk. Az úgynevezett dclta-endotoxin hőre érzékeny, magasabbrendűekre veszélytelen. A B. thuringiensis var. kurstaki kristályai csak pikkelyes szárayúakra toxikusak. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
