201608. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vankomicin típusú antibiotikumok meghatározására , az ehhez szükséges analitikai készlet és eljárás a specifikus antitest előállítására
1 Hü 201608 B 2 A találmány tárgya új, réteges eljárás (ún. szendvics-módszer) vankomicin típusú glükopeptid antibiotikumok - amelyek egy D-alanil-D-alanin dipeptidhez vagy egy D-alanil-D-alanin karboxi-terminális oligopeptidhez képesek kötődni - meghatározására. Az eljárás egyesíti a megfeleló D-alanil-D-alanin származékok magasfokú szelektivitását a vankomicin típusú antibiotikumok iránt és a meghatározás tárgyát képező antibiotikum típussal szembeni antitest specificitását, Példák a vankomicin osztályba sorolható antibiotikumokra (a vankomicinen kívül): teikoplanin, aktaplanin, risztocetin, avoparcin, aktinoidin, LL-AM-374 antibiotikum, A 477 antibiotikum, OA 7653 antibiotikum, A 35512 B antibiotikum, A 515 668 antibiotikum, AAD 216 antibiotikum, A 41030 antibiotikum, A 47 934 antibiotikum, valamint ezek egyes komponensei, származékai és aglükonjai. Ismeretes, hogy a vankomicin és a risztocetin A befolyásolja a peptidoglükán szintézisét, amely a baktérium sejtfalának fó szerkezeti komponense. Feltételezhető, hogy ez a hatás - amely a sejtnövekedés gátlásához és végsó soron a sejtfal lizis következtében fellépő lebomláséhoz vezet - azzal függ össze, hogy fajlagos kötés jön létre ezen antibiotikumok és a karboxi-terminélison egy D-alanil-D-alanin (D-Ala-D-Ala) maradékot tartalmazó pentapeptid prekurzor [UDP-N-acetil-muramil-pentapeptid (között) H.R. Perkins, Biochem. J. 111, 195, (1969)]. Újabban azt találták, hogy a teikoplanin ugyanezen mechanizmus szerint fejti ki hatásét, azaz az érzékeny bektériumokban a növekedés során a peptidoglükánhoz kapcsolódik. Közelebbről azt találták, hogy a teikoplanin, a vankomicinhez, risztocetin A-hoz és hasonló antibiotikumokhoz hasonlóan, a karboxi-terminálison egy D-Ala-D-Ala dipeptidet tartalmazó peptidoglükánhoz kötődik. Ennek folytén az antibiotikumok valószínűleg gátolják a bakteriális transzpeptidázt és gátolják a sejtfal peptidoglükánjában keresztkötések kialakulását. Ezek az antibiotikumok ugyancsak kötődnek egy D-alanil-D-alanin dipeptidhez vagy egy D-alanil-D-alanin karboxi -terminális oligopeptidhez. A vankomicin osztályba sorolható többi antibiotikumról is bebizonyosodott vagy feltételezhető, hogy ugyanilyen mechanizmus szerint fejti ki hatását, ezért képes arra, hogy egy D-alanil-D-alanin dipeptidhez vagy egy D-alanil-D-alanin karboxi-terminális oligopeptidhez kötődjék [Tetrahedron 40 (3), 569 (1984)] és hogy megfeleló gazdaszervezetben kiválthatja ezekkel szemben antitestek képződését. A vankomicin osztályba sorolható antibiotikumokon kívül a találmány szerinti eljárás megfelelően alkalmazható más olyan, nemglükopeptid vagy nem-vankomicin típusú antibiotikumok meghatározására is, amelyek képesek egy D-alanil-D-alanin dipeptidhez vagy egy D-alanil-D-alanin karboxi-terminális oligopeptidhez való kötődésre és megfelelő gazdaszervezetben kiválthatják ezekkel szemben antitestek képződését. A D-alanil-D-alanin vagy egy D-alanil-D-alanin oligopeptid tehát .molekuláris receptornak’ tekinthető az előbbiekben említett antibiotikumok vonatkozásában. Az antibiotikumok - és különösen a teikoplanin és a vankomicin osztályba tartozó többi antibiotikum - meghatározására ismert eljárások eddig főként a TLC, HPLC technikákon vagy érzékeny mikroorganizmusokkal végzett biológiai meghatározáson alapultak (pl. EP-A 122 969). Néhány ilyen antibiotikum jelenlegi terápiás alkalmazására vagy előrehaladott klinikai vizsgálatára tekintettel szükség van vizsgálati módszerekre ezek folyadékokban - különösen biológiai folyadékokban - való meghatározására. A kivánalom ezekkel a módszerekkel szemben az, hogy legyenek fajlagosak, gyorsak, könnyen kivitelezhetók, megbízhatók és automatizálhatók. Az említett anyagoknak a test váladékában, a hörgőkből származó köpetben, gennyben, bőrmintákban (égési sérüléseket szenvedett betegek esetében) stb. való meghatározása az ismert technikák alkalmazása esetén különösen bonyolult, mivel gyakran tévesen pozitív eredményt kapunk. A találmány szerinti eljárás ezzel szemben az ilyen minták esetében is pontos és megbizható. A találmány szerinti eljárás ezért gyors, könnyen kivitelezhető, megbízható, közvetlen módszert képvisel olyan anyagok fajlagos meghatározására, amelyek rendelkeznek azzal a tulajdonsággal, hogy egy, a D-alanil-D-alanin vagy egy D-alanil-D-alanin karboxi-terminális oligopeptid által képviselt .molekuláris receptorhoz" kötődnek. A találmány szerinti eljárás közelebbről lehetővé teszi valamely, a vankomicin osztályba sorolható antibiotikum specifikus meghatározását - nagy érzékenységgel, pontossággal és szabatossággal - még ugyanebbe az osztályba sorolható más antibiotikumok jelenlétében is. A találmány szerinti eljárás pontosabban a következő műveleteket foglalja magában: I) a vizsgálati oldatot érintkezésbe hozzuk egy felülettel, miután erre a felületre előzetesen felvittünk egy megfelelő makromolekuláris - a felületre adszorbeálódni képes - hordozóval konjugált (D-alanil-D-alanin dipeptidet vagy D-alanil-D-alanin karboxi-terminális oligopeptidet; II) öblítés után a meghatározandó anyag specifikus antitestjeit adjuk a rendszerhez; III) az antigénhez kötött ilyen antitesteket a stacionárius fázisban kimutatjuk az ilyen kötött antitestek fajta-specifikus IgG-antitestjeivel (anti-antitest-antiszérummal), amelyeket egy kimutatható markerral kapcsoltunk össze. 5 L0 15 10 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
