201534. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a vér kórosan magas koleszterinszintjét csökkentő tetrazol-származékok és az ezen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 201534 B 2 állatok gyomrába, e célra a vizsgálandó vegyületek nátrium-sóját, laktonját vagy észterét 0,5-1,0 ml vízben vagy propilén-glikolban oldjuk. A kontroll állatok azonos térfogatú vivőanyagot kapnak. 30 perccel a vizsgálandó anyag adagolása után a patkányoknak intraperitoneális (a hasüregbe adott) injekció formájában beadunk 0,9 ml 0,9 %-os nátrium-klorid-oldatot, amely testtömegkilogrammonként körülbelül 4,44xl06 Bq aktivitású nátrium [1-14C] acetátot £3,7—1 l.lxlO7 Bq/mmól] is tartalmaz. 60 perces beépülési időszak után a patkányokat leöljük, és májukból valamint vérükből mintákat veszünk. A heparinnal és etilén-diamin-tetraecetsavval kezelt vér centrifugálása útján kapott plazmából 1,0 ml térfogatú mintákat veszünk, míg a homogenizált májból vett minták megfelelnek 0,50 g nedves tömegnek. Ezekben a mintákban meghatározzuk a radioaktív izotóppal jelzett 3-hidroxi-szteroidok mennyiségét. A máj- mintákból a szteroidokat Kates módszere szerint [Techniques in Lipidology, (A lipidek vizsgálatának módszerei), szerkesztette: M. Kates, 349, és 360-363. oldal, North Holland Publ. Co., Amsterdam, 1972) különítjük el, míg a plazma-mintákat közvetlenül hidrolizáljuk, majd a digitoninnal kicsapható szteroidokat elkülönítjük. A 14C-izotóppal jelzett szteroidok mennyiségét folyadékszcintillációs számlálóval határozzuk meg (az eredményt korrigáljuk). A kezelt állatok csoportjaira nézve kiszámítjuk a 14C-izotópnak a máj és plazma koleszterinjébe való beépülésének átlagos %-os gátlását, és ezt az értéket összehasonlítjuk a hasonló módon végzett kontrolikísérletekben kapott átlagos értékekkel. így a fenti vizsgálat felvilágosítást ad arra nézve, hogy milyen mértékben képesek a vizsgált vegyületek in vivo körülmények között (az élő szervezetben), patkányokban, orális (szájon át való) adagolás mellett a koleszterin bioszintézisét visszaszorítani. így például a fenti vizsgálatban a 4. példa szerinti vegyület 50 %-os gátló dózisa (ED50) mind a plazma, mind a máj koleszterin-tartalma tekintetében összehasonlítható nagyságú a Mevinolinnal (Lovastatinnal) egy hasonló kísérletben kapott értékekkel [Alberts és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei., 77, 3957-3961 (1980)]. A találmány szerinti eljárást a továbbiakban - a találmány oltalmi körének szűkítése nélkül - példákkal szemléltetjük. A példákban a hőmérséklet-értékeket Celsius fok egységekben adjuk meg. Az olvadáspontértékeket egy Thomas-Hoover-féle kapilláris olvadáspont-meghatározó készülékben mértük meg, a forrpontokat pedig a megadott nyomásokon határoztuk meg. E kétféle hőmérséklet-értéket nem korrigáltuk. A proton-mágneses magrezonancia (’H-NMR) spektrumokat Braker AM 300, Bruker WM 360 vagy Varian T-60 CW spektrométeren vettük fel. Ezeket a spektrumokat deutero-kloroformos (CDCI3), deutero-dimetil- szulfoxidos (DMSO-ds) vagy deutériumoxidos (D2O) oldatban vettük fel, illetve az ettől való eltéréseket külön megadjuk. A kémiai eltolódásértékeket delta-egységekben adjuk meg, a delta-skála a belső összehasonlító anyagként használt tetrametilszilántól (TMS) a csökkenő térerősség irányába halad. A protonok egymás közötti kapcsolási állandóit Hertz (Hz) egységekben adjuk meg. A jelek felhasadását az alábbi jelölésekkel jellemezzük: s - szingulett; d - dubblett; t - triple»; q - kvartett; m - multiple«; br - széles; v.br - nagyon széles; dd - dublett dublettje. A szén-13 mágneses magrezonancia (13C-NMR) spektrumokat Bruker AM 300 vagy Bruker WM 360 spektrométeren vettük fel, szélessávos protonlecsatolással. A spektrumokat deutero- kloroformos, deuterodimetil-szulfoxidos vagy deutérium-oxidos oldatban vettük fel, illetve az ettől való eltéréseket külön megadjuk. A mérésekhez belső deutérium-lock-ot használtuk (összehasonlító jelként a deutérium jelét stabilizáltuk). A kémiai eltolódás-értékeket delta-egységekben adjuk meg, a delta- skála a tetrametil-szilántól a csökkenő térerősség irányába halad. Az infravörös (IR) spektrumokat egy Nicolet MX-1 FT spektrométeren, 4000 cm'1 és 400 cm'1 közötti tartományban vettük fel, a spektrométert egy polisztirol film 1601 cm'1 hullámszámnál jelentkező adszorpciójára kalibráltuk. A jellemző csúcsok helyét reciprok centiméter (cm1) egységekben adjuk meg. A csúcsok relatív intenzitásának jellemzésére az alábbi jelöléseket alkalmazzuk: s - erős; vs - nagyon erős; m - közepes; w - gyenge. A tömegspektroszkópiával kombinált gáz-kromatográfiás (GC-MS) vizsgálatokat egy Finnigan 4500 jelzésű, gázkromatográffal kombinált, négycsatomás tömegspektrométerrel végeztük, ionizációs potenciál: 70 eV. A tömegspektrumok felvételéhez használtunk egy Kratos MS-50 készüléket is, a gyorsatom-ütköztetéses (FAB) módszerrel. A tömegspektroszkópiai adatokat az alábbi formában közöljük: molekula ion (M+), vagy protonált ion (M+H+). Az analitikai célú vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatokat gyárilag készített (60F-254) szilikagél lemezeken végeztük, a foltok helyét ultraibolya fényben, jódgőzök segítségével és/vagy valamely alábbi reagenssel befújva határoztuk meg: a) 2 %-os metanolos foszformolibdénsav, majd melegítés; b) 2 %-os metanolos foszformolibdén, majd kobalt-szulfát 2 %-os oldata 5 mólos kénsav-oldatban, majd melegítés. Az oszlopkromatográfiás elválasztásokat (gyorskromatográfiás elválasztásokat) üveg-oszlopokba töltött, finom eloszlású (32-63 pm szemcseméretű) szilikagél-H-adszorbensen végeztük, az alkalmazott nyomás valamivel az atmoszférikus fölött volt, eluensként az egyes esetekben megadott oldószereket használtuk. Az oldószereket minden esetben csökkentett nyomáson desztilláltuk le. A jelen leírásban a „hexán (izomerkeverék)” kifejezés a 6 szénatomot tartalmazó izomer szénhidrogének keverékét jelenti, amint ezt az Amerikai Kémiai Társaság meghatározta. A „semleges gáz atmoszféra” kifejezés argonvagy nitrogén- atmoszférát jelent, amennyiben külön másképp nem adjuk meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
