201515. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2,6-difluor-benzamid előállítására mikrobiális hidrolizissel, valamint eljárás az eljárásban alkalmazható mikroorganizmus tenyészet előállítására
1 HU A találmány tárgya eljárás 2,6-difluor-benzamid előállítására. A 0 133 927 számú európai közrebocsátási irat ismerteti egy nitrilvegyület átalakítását a megfelelő amiddá. bizonyos, e célra alkalmas mikroorganizmusok hatására. Ezeknek a mikroorganizmusoknak a hatásossága általában fokozható fénybesugárzással. A bejelentésben ismerteti e célra alkalmas mikroorganizmusok az alábbi gramm-pozitív baktérium-nemzetséghez tartoznak: (a) Corynebacterium; (b) Nocardia; (c) Bacillus: (d) Bacteridium; (e) Mikrococcus: és (f) Brevibacterium. Ezt az eljárást elsőként akrilamidnak akrilnitrilből és nikotinsavnak ciano-piridinből való előállításra közölték. Konkrétan leírták továbbá az acetonitril acetamiddá. metakrilnitril metakrilamiddá, valeronitril valeramiddá, benzonitril banzamiddá, propionitril propionamiddá, n-butironitril n-butiramiddá, malonsavnitril matonamiddá, borostyánkőnitril borostyánkősavamiddá, furmársavnitril furmársavamiddá, klór-acetonitrll klór-acetamiddá és ß-hidroxi-propionitril ß-hidroxi-propionamiddä történő átalakítását. D. B. Harper [Biochem. J. 765, 309 (1977)] leírja benzonitril metabolizmusát benzoesavvá a Nocardia Sp. NCIB 11216 törzs hatására, továbbá a nitriláz-enzim elkülönítését ezen mikroorganizmusból és az enzim sajátságait. A 317. oldalon található 4. táblázatban a szerző közli különbözőképpen szubsztituált benzonitrilek hidrolízisének viszonylagos sebességét az enzim hatására. Úgy látszik, hogy e sebességet messzemenően befolyásolja a 2-es helyzetben kötődő szubsztituens szférikus gátlása. Ennek következtében a 2-fluor-benzonitril hidrolízisének sebessége kisebb, mint a benzonitril hidrolízis-sebességének 30 százaléka: a 2- -klór-benzonitril és a 2-metil-benzonitril hidrolízisének sebessége lényegében zérus; ezzel szemben a 4-fluor-, 4-klór- és 4-metil-benzonitril hidrolízisének sebessége lényegesen nagyobb, mint a benzonítrilé. Ebből ésszerűen az következik, hogy egy 2,6-díszubsztituált benzonitril - mivel sztérikusan még inkább gátolt - az enzimes hidrolízissel szemben teljes mértékben ellenálló. Valóban, Harper azt találta, hogy az enzim a 2.6-diklór-benzonitrilt (ez a dichlobenil néven ismert herbicid szer) még nagy koncentrációk esetében sem támadta meg; sőt a 3.5-dibróm-benzonitril (a bromoxynil néven ismert herbicid) is változatlan maradt az enzim nagy koncentrációinak jelenlétében is. azon tény ellenére, hogy a 3-bróm-benzonitril hidrolízisének sebessége több mint 70 %-al haladta meg a benzonitril hidrolízis-sebességét. Harper megjegyzi továbbá, hogy Verloop szerint [Residue Rev. 43. 55 (1972)] az orto-helyzetű monoszubsztitúció csökkenti aromás nitrilek alkálikus hidrolízisének sebességét és az orto-. orto-helyzetű diszubsztitúció teljesen meggátolja a folyamat lejátszódását. Meglepő módon azt találtuk, hogy a 2.6-difluor-benzonitril mikrobáiig úton (mikroorganizmusok o 5 B 2 segítségével) hidrolizálható; továbbá váratlanul egy olyan új mikroorganizmust találtunk, amelynek hatására a 2,6-difluor-benzonitril magánál a benzonitrilnél is gyorsabban hidrolizál. Mindezek alapján a találmány tárgya eljárás 2,6-diluor-benzamid előállítására, amely abban áll, hogy 0-37 °C hőmérsékleten, 6-9 pH-értéken 2,6- -difluor-benzonitrilt Rhodococuss Sp. NCIB 12218 mikroorganizmus törzshöz tartozó mikroorganizmussal vagy annak mutánsaival vagy variánsaival kezelünk. A Rhodococcus nemzetségének a találmány szerinti eljárásban előnyösen alkalmazható baktériumfajtáját talajból különítettük el a Shell Haven Refinery iszapkezelő telepén (Stanford-le-Hope, Essex, Anglia) és letétbe helyeztük a ’’Nationál Collection of Industrial Bacteria (NCIB)” gyűjteményében (Torrey Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Scotland) 1986. március 13-án a ’’Szabadalmi Eljárás Céljaira Szolgáló Mikroorganizmusok Letételének Nemzetközi Elismerése Tárgyában Kötött Budapesti Megegyezés” előírásai szerint. E letétben a fenti baktériumfaj az NCIB 12218 lajstromszámot kapta: az alábbiakban e mikroorganizmust ’’Rhodococcus Sp. NCIB 12218”-nak nevezzük. Ez az új Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mikroorganizmus - amint ezt az alábbiakban részletesen leírjuk - képes arra, hogy a 2,6-difluor-benzonitrilt a benzonnitrilnél nagyobb sebességgel hidrolizálja. Ennek megfelelően a találmány szerinti eljárásban a Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mikroorganizmust vagy annak valamilyen mutánsát vagy variánsát, célszerűen a Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mikroorganizmust alkalmazzuk. A találmány tárgya továbbá eljárás a Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mikroorganizmus törzs előállítására, mely eljárás során Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mikroorganizmust megfelelő táptalajon tenyésztünk. A Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mutánsai ismert eljárásokkal képezhetők, elkülöníthetők és elválaszthatók. A mutációt elérhetjük kémiai úton, például N-metil-N'-nitro-N-nitrozo-guanidinnal; vagy fizikai eszközökkel, például ibolyántúli besugárzással. A 2.6-difluor-benzamid ismert közbenső termék ismert inszekticid vegyületek - például a diflubenzuron - előállítása során (lásd az 1 324 293 számú nagy-britanniai szabadalmi leírást). Az 1 460 419 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás és a 0 161 019 számú európai közrebocsátási irat további eljárásokat közölnek, amelyek során a 2,6-difluorbenzamidot közbenső termékként használják inszekticid hatású vegyületek előállítására. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható mikroorganizmusok olyan megfelelő, ismert táptalajokon szaporíthatok, amelyek asszimilálható nitrogénforrást (például ammónium-szulfátot, ammónium-nitrátot vagy ammónium-kloridot), szerves tápanyagforrást (például élesztőkivonatot, malátakivonatot, peptont vagy húskivonatot) és szervetlen nyom-tápanyagokat (például foszfátot, magnézium-, kálium-, kalcium-, mangán-, cink- és/vagy vassókat) tartalmaznak. A mikroorganizmusokat általában 20-37 ”C hőmérséklettartományban, 5-9 pH-tartományban. oxi-20151 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
