201411. lajstromszámú szabadalom • Glutén-enteropátia kimutatására alkalmas reagens készlet és eljárás glutén -enteropátia kimutatására

1

HU 201411 B

2

c) fiziológiás sóoldat, amely foszfáttal van pufferolva (PBS) 1,5 1 desztillált vízzel történő hígítás után a pH-7,2-7,4 közötti.

d) pozitív kontroll szérum (500 pl)

e) negatív kontoll szérum (500 pl)

f) immunológiai oldat, amely peroxidázhoz (a hlgA-HRP) kötött antihumán A-immunoglobulin antitestből áll, (400 pl),

g) sósavas puffer (trisz-HCl), (1000 pl 9 ml desztilláltvíz hozzáadása után a pH-7,5-7,6),

h) 1000 pl hidrogén-peroxid (H2O2),

i) 5 mg 3,3’-diamino-benzidin-tetrahidroklorid (DAB),

j) 1000 ml glicerin,

A példa szerinti reagens készlet segítségével a glutén- enteropátiát a következőképpen mutatjuk ki:

1) 0,01 mólos PBS-t készítünk, amelynek pH-7,2- 7,4

2) hígított pozitív kontroll szérumokat készítünk a következő hígításokban PBS-ben:

1:2,5; 1:5; 1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160;

3) hígított negatív kontroll szérumot készítünk 1:2,5 hígításban,

4) hígított vizsgálandó szérumot készítünk, úgy ahogy a pozitív kontroll szérumot készítjük,

5) minden hígításból 50 pl-t felviszünk az egyes szövetpreparátumokra,

6) 30 percig inkubáljuk a preparátumokat, szobahőmérsékleten,

7) a szérumot PBS-ben lemossuk,

8) 50 pl a hlgA-HRP-t alkalmazunk minden preparátumra,

9) a preparátumot 30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk,

10) az immunológiai oldatot PBS-ben lemossuk,

11) oldatot készítünk a következő összetétellel: 0,05 mólos trisz-HCl 0,03 tömeg % H2O2 és 0,05 töneg % DAB (ez az oldat váltja ki az elszíneződést a készítményben),

12) a 11. pont szerint készített oldatból 50 pl-t viszünk fel minden szövetpreparátumra,

13) a preparátumokat PBS-ben mossuk,

14) 1 csepp 10 tömeg % PBS-t tartalmazó glicerint csepegtetünk az egyes preparátumokra, és fedőüveget helyezünk rájuk,

15) a preparátumokat 300-szoros nagyítású fénymikroszkóp alatt vizsgáljuk.

Ha a vizsgált szérumban antihumán A-immunoglobulin antitest fordul elő, akkor a szövetpreparátumok jellegzetessége barna elszíneződése figyelhető meg. Ilyen elszíneződést a negatív kontroll szérumot tartalmazó szövetpreparátumoknál nem lehet tapasztalni.

2. példa

A glutén-enteropátia kimutatására alkalmas reagens készlet a következőket tartalmazza:

a) 12 db szövetpreparátumot tartalmazó üveglap,

b) pufferolt fiziológiai só (PBS) 1,5 1 pH-7,2-7,4 oldat előállításához,

c) pozitív kontroll szérum (4x100 pl),

d) negatív kontroll szérum (4x100 pl),

e) immunológiai oldat, amely fluoreszcein izotiocianáthoz (a hlgA-FTTC) kötött antihumán A-immunoglobulin antitestből áll, (4x40 pl),

f) parafenilén-diamin (2x1 mg),

g) glicerin (2x1000 pl).

A második példa szerinti reagens készlettel a glutén-enteropátia kimutatására szolgáló eljárást a következőképpen végezzük:

I) -7)-ig az első példában leírtak szerint járunk el,

8) 50 pl a hlgA-FITC összetételt alkalmazunk minden szövetpreparátumra,

9) a preparátumokat 30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk,

10) PBS-sel mossuk a preparátumokat,

II) 1 mg parafenilén-diamint 1 ml puffereit glicerinben oldunk,

12) all. pont szerint előállított oldatból 1 cseppet csepegtetünk minden prepeparátumra,

13) a preparátumokat fluoreszcenciamikroszkóp alatt 300-szoros nagyítás mellett vizsgáljuk.

A találmány szerinti eljárással kvalitatív és kvantitatív vizsgálatok végezhetők. Kvalitatív vizsgálat esetén előzetesen meghatározható, hogy a vizsgált szérumban előfordul-e antihumán A-immunoglobulin antitest.

Kvantitatív vizsgálat esetén az antitest mennyiségét határozzuk meg a szérumban.

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás glutén-enteropátia immunológiai kimutatására a szövetpreparátumra vizsgálandó szérum és kontroll szérum csepegtetésével, inkubálásával és lemosásával, azzal jellemezve, hogy szövetpreparátumra preparátumonként 40-50 pl immunológiai összetételt cseppentünk, amely preoxidázhoz kötött antihumán A- immunglobulin antitestet tartalmaz, majd inkubálás után a preparátumot lemossuk, és szövetpreparátumként legfeljebb 50 pl 3,3’-diamino-benzidin-tetrahidrokloridot vagy p-fenilén-diamint csepegtetünk a preparátumokra, majd a szövetpreparátumot mossuk, és fénymikroszkóp alatt megfigyeljük a szövetpreparátumok elszíneződését azokon a helyeken, ahol az összetétel megkötődött.

2. Glutén-enteropátia kimutatására alkalmas reagens készlet, amely tartalmaz szövetpreparátumokat, azokra felvitt kontroll szérumokat és a szérumok mosására és hígítására alkalmas szereket, azzal jellemezve, hogy szövetpreparátumonként 40-50 pl antihumán A-immunoglobulin antitestet valamint szövetpreparátumonként legfeljebb 50 pl 3,3’diamino-benzidin-tetrahidrokloridot vagy p-feniléndiamint is tartalmaz.

3