201355. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kinin, kinidin és dihidro-származékaik mikrobiológiai hidroxilezésére
3 HU 201355 B 4 mok konfigurációjában van. A hidrogénezett származékok esetében R jelentése etilcsoport, e származékok tehát a dihidrokinin és a difiid rokinidin. Ugyanez a meghatározás vonatkozik a (II) általános képletü, hidroxilezett származékokra is. A mikrobiológiai hidroxilezés céljára előnyösen alkalmazhatók a kővetkező törzsek: Cunninghamella echinulata (NRRL 3655, MMP 2203), Mucor circinelloides (CBS 108-16), Mucor plumbeus (MMP 430, CBS 111-07), Streptomyces rimosus (NRRL 2234). A találmány szerinti eljárás abban áll, hogy a fentebb felsorolt mikroorganizmusok tenyészetének egyikét a hidroxilezni kívánt (I) általános képletű vegyülettel kölcsönhatásba hozzuk. A fenti jelzések jelentése a szokásos, tehát a következő: NRRL: Mezőgazdasági Kutatási Tenyészetgyűjtemény, Északi Körzeti Kutatóközpont, Peoria, Illinois; CBS: Központi Penészgomba-Tenyészeti Hivatal, Baarn, Hollandia; MMP: A Természettörténeti Múzeum Gombagyűjteménye, Párizs, Franciaország. A találmány szerinti mikrobiológiai hidroxilezó eljárás során előnyös a mikroorganizmusokat olyan tenyésztóközegben szaporítani, amelyek asszimilálható szén-, nitrogén- és ásványisó-forrást tartalmaznak; előnyős a tenyésztést aerob fermentációs körülmények között, süllyesztett tenyészettel végezni. A hidroxilezni kívánt vegyületet előnyösen steril körülmények között adjuk a közeghez, és addig inkubáljuk, amíg kielégítő mennyiségű hidroxilezett termék képződik. Az extrakciót szokásos módszerekkel végezzük. Az inkubálást szokásos típusú fermentorban hajtjuk végre, megközelítőleg 20-30 °C közötti hőmérsékleten, közel 7-es pH-érték mellett. Kívánt esetben olyan közeget is alkalmazhatunk, amelynek pH-értéke megközelítőleg 6 és 8 között van: ennek következtében az eredmények alig változnak. A találmány szerinti eljárás során a mikroorganizmusokat alkalmas tenyésztőközegben szaporítjuk megfeleleö biomassza előállítása céljából. A közeghez asszimilálható szénforrást (például dextrózt, szacharózt, keményítőt vagy mannitot) adunk 1-10% koncentrációban; a közeg akár szerves (peptonok, aszparagin, fehérjehidrolizátum), akár szervetlen (ammóniumsók, nitrátok) nitrogénforrást tartalmazhat. A közeg tartalmazhatja továbbá a szükséges ásványi sókat, valamint vitaminokat, például az élesztőkivonatban jelenlévő vitaminokat; az eljárás során a hőmérséklet megközelítőleg 20-30 °C között változtatható az alkalmazott törzstől függően. A tenyésztést keverés közben végezzük. Amikor a mikroorganizmusok szaporulata kielégítőnek tekinthető - általában amidőn a szénhidrogén-szubsztrátum elfogy - azaz körülbelül 2-5 nap elmúltával, akkor a hidroxilezni kívánt (I) általános képletű vegyületet szilárd formában, vagy kis térfogatú, vízzel elegyedő szerves oldószerben, például etanolban oldva, steril körülmények között hozzáadjuk olyan mennyiségben, hogy a végső koncentráció a molekulának vagy az alkalmazott törzsnek megfelelően 0,2 g/liter és néhány g/liter között legyen. Az inkubálást - aminek során kismértékű szaporodás még végbemehet - erélyes keverés közben azonos hőmérsékleten 2-40 napon át végezzük. A találmány szerinti eljárás egy másik megvalósítási módja szerint úgy járunk el, hogy a hidroxilezni kívánt (I) általános képletű vegyület inkubálását előzőleg mosott, és szenet vagy nitrogént nem tartalmazó pufferolt vizes közegben reszuszpendált sejtekkel végezzük. A hidroxilezés akkor valósul meg, amikor a mikroorganizmusok elszaporodtak, és a szaporodás megszűnte után a micéliumot összegyűjtöttük. Az inkubálás termékeinek, valamint a maradék szubsztrátumnak az extrakcióját vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel (például diklór-metánnal, kloroformmal vagy etil-acetáttal) hajtjuk végre a micéliumnak szűrés útján való elkülönítése és az oldószernek sókkal (például nátrium-kloriddal, nátrium-szulfáttal) való telítése után. A hidroxilezés termékeinek kimutatását és azonosítását szilikagél-rétegen végzett folyadékkromatográfiával végezhetjük. A hidroxilezett terméknek az eredeti anyag maradékától való elkülönítését (ha ilyen anyag marad) és tisztítását a hagyományos kristályosítási, vagy ásványi adszorbensekkel végzett kromatográfiás módszerekkel hajthatjuk végre. A tisztított, hidroxilezett terméket úgy azonosítottuk, hogy az irodalomban leírt, kémiai eljárásokkal előállított, autentikus (3S )— -hidroxi-származékokkal összehasonlítottuk egyrészt különböző kromatográfiás rendszerekben, másrészt a szokásos szinképi (UV, XH-NMR vagy 13C-NMR) és polarimetriás módszerek segítségével. Az így kapott eredményeinket az alábbi példákban írjuk le, amelyekben több, regio- és sztereoszelektív hidroxilezésre alkalmas törzset alkalmaztunk és több (I) általános képletű kiinduló anyagot használhatunk. Megállapítottuk a különböző konverziós arányokat. A mikrobiológiai hidroxilezés szelektivitása mellett azzal a további előnnyel jár, hogy egyéb metabolitok jelentős mennyiségben nem képződnek, így a tisztítás egyszerűbbé válik, és a nem-metabolizált szubsztrátum reciklizálható (a folyamatba visszavihető). A találmány szerinti eljárást az alábbi, nem-korlátozó jellegű példákban részletesen ismertetjü 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
