201350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazmidok stabilizálására
17 HU 201350 B 18 Bzitettünk ki (hogy indukáljuk a mal B fehérjét, amely a A receptor) egy éjszakán át növesztettünk rázatás mellett. A sejteket 0,9% NaCl oldattal mostuk, és 2 ml 0,01 mól/literes MgSO« oldatban szuszpendáltuk, majd 5 1 óra hosszat inkubáltuk. A szuszpenzióból hígításokat készítettünk (10°, ICH, 10"2), és 0,1 ml-nyi hígított fág-oldatokat használtunk 0,2 ml éhező sejtszuszpenzió megfertőzésére. A fertőző keverék 10°, 10'1 és 10 2 hígítása- 10 it szelektív lemezekre szélesztettük. A plazmidok Tn 5-tel (Km*) történő transzponálásához (a Tn 5 ,A.b 221 : : Tn 5 tág eredetű, amely a kapcsolás oldaláról törlést tartalmazott, Így nem volt képes lizogenizálni), a fág szuszpenzióját alkalmaztuk az olyan sejtek fertőzésére, amelyek azokat a plazmidokat tartalmazták, amelyekre a transzponálást végre akartuk hajtani. A fertőzést a fentebb leírtak szerint hajtottuk végre és a kanamicin-rezisztens sejteket kiválasztottuk. Több ezer Km* telepet gyűjtöttünk össze, és ezek 10~z hígításaiból 0,1 ml-t alkalmaztunk 100 ml LB tápközeg inokulálására. A tenyészetet egy éjszakán át növesztettük, és a plazmid DNS-t ebből a sejtkeverékból kinyertük és felhasználtuk E. coli K 12 törzs (CSH50) kanamicin rezisztenciára történő transzformálásához. (Az E. coli K12 CSH50 törzs beszerezhető a Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor New York, USA intézettől). 15 2. táblázat Plazmidok és fágok Plazmid/Fág Forrás pKN184 Nordstrom és munkatársai: Plasmid 4, 1980, 322. oldal pSF 2124 So és munkatársai: Mol. Gen. Genet. 142, 1975, 239-49. oldal pJL 99 Light és Molin: Mol. Gen. Genet. 184, 1981, 56-61. oldal pGA 46 An és Friesen: J. Bact. 140, 1979, 70-79 oldal pKN 501 Molin és munkatársai: J. Bact. 138, 1979, 70-79. oldal pF 1403-11 Az F plazmid alap-replikonból származó AluINae I fragmens pMC 1403 Sma I helyére történő beiktatásával előállítva (Casadaban és munkatársai: J. Bact 143, 1980, 971. oldal), ezáltal az F plazmid E génje és a pMC 1403 lac Z génje között egy fúziót alakítva ki. pHP 34 Prentki és munkatársai: Gene 17, 1982, 189-96. oldal pMC 903 Casadaban és munkatársai: J. Bact. 143, 1980, 971. oldal pKN 1562 Molin és munkatársai: J. Bact. 138, 1979, 70-79. oldal pVH 1424 Valentin-Hansen P. szerint állítva elő, egy pVH 17 plazmidból (Valentin-Hansen és munkatársai: EMBO J. 1982, 317) származó deo promotort hordozó Sau 3 A fragmens beiktatásával a PMC 1403 plazmid BamH I helyébe (Casadaban és munkatársai, fentebb idézett hely, 971. oldal) pSKS 104 Casadaban M. szerint állítva elő, a pM 13 mp 7-ből (Messing és munkatársai: Nucleic Acids Res. 9, 1981, 309) származó lac promotort és transzlációs beindító területet tartalmazó Pvu II fragmens beiktatásával a pMC 1403 Sma I helyére, amely műveletet homológ rekombináció követ a lac Z szegmensek között pBR 322 Bolivar és munkatársai: Gene 2, 1977, 95. oldal pMB 1 Betlock és munkatársai: Fed. Proc. 35, 1976, 2037-43. oldal 4 b 221 : : Tn 5 Berg, D. E.: .transzponálható kanamicin rezisztenciát meghatározó Tn 5 beiktatása és kivágása’ DNS Insertion Elements, Plasmids and Episomes (A.I.Bukhari és munkatársai szerkesztésében) ED^.4 Dempsey és Willets: J. Bact. 126, 1976, 166. oldal 11
