201350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazmidok stabilizálására
13 HU 201350 B 14 gyorsabb növekedés alapján történt kiigazítást, ami a tényleges elvesztési gyakoriságot mutatja. Ezzel ellentétben azok a plazmidok, amelyek fenotipikusan Par* típusúak, 1,5 • 10*2- /sejt/generáció gyakorisággal vesznek el RÍ plazmidoknál, 1 ■ 10*2/se jt/generáció gyakorisággal a pl5 plazmidoknál és 6 ■ 10*3- /sejt/generáció gyakorisággal néhány pBR 322 plazmidnál (egy ilyet mutatunk be a 3.3 példában). Valóban, a pl5 Par* és a pBR 322 Par* származékok elvesztési gyakorisága meglepően nagy, ha ezeknek a vektoroknak a kópiaszámát figyelembe vesszük. Így pl. a pl5 kópiaszáma 15-20 körül mozog sejtenként, arai 10*9/sejt/generáció elvesztési sebességet jelent, ha a plazmidok binomiális eloszlását tételezzük fel. A megfigyelt nagy elvesztési arány könnyén megmagyarázható azzal a ténnyel, hogy a pl5 replikonok a rec A-függően kapcsolt egységet képeznek, valószínűleg egy loxP-szerű felbontó (resolúciós) funkció hiánya miatt. (Austin és munkatársai, Cell, 25, 1981, 729-36 oldal). A pBR 322 származékokról is ismeretes, hogy kapcsolt egységeket képeznek, és amikor a kópiaszám csökken pl. a nagy klónozott fragmensek miatt, jelentős instabilitás jón létre. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Az alkalmazott Escherichia coli K-12 törzs CSH50 volt (apro-lac, rpS L; lásd: Miller, J.: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1972). Többféle plazmidot és bakteriofágot használtunk (lásd 2. táblázat). Az alkalmazott kísérleti technikák standard technikák, amelyeket a mikrobiológiai genetika terén (Miller, J.: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1972), valamint a genetikai manipulációk terén (Davis, Batstein és Roth: A Manual for Genetic Engineering; Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1980) általában használnak. Az összes sejtet LB tápközegen tenyésztettük (Bertani: J. Bact. 62, 1951, 293 oldal), amely 0,2% glükózzal és 1 pg/ml tiarainnal volt kiegészítve; vagy A+B minimális tápközegen (Clark és Male, J. Mól. Bioi. 23, 1967, 69. oldal), amely 0,2% glükózzal és 1% kazamino-savval volt kiegészítve. Az alkalmazott lemezek LB tápközeget és 1,5% agart tartalmazó LA lemezek voltak. A McConkey laktóz indikátorlemezeket a gyártó cég (Difco) ajánlása szerint készítettük, és az X-gal lemezeket 20-40 pg/ml 5- -bróm-4-klór-indolil-£i-D-galaktozid hozzáadáséval A+B minimáltápközegból készítettük, amely még 0,2% glükózzal és 1 pg/ml tiaminnal volt kiegészitve. Fiziko-kémiai módszerek A tiszta lizátumokat a Clewell és Helinski által leirt módszerrel készitettük (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 62, 1962, 1159-66. oldal). A plazmid DNS kis mennyiségű készítését Bimbóim és munkatársai módszere szerint hajtottuk végre (Nucl. Acids Res. 7, 1979, 1513-23. oldal). A plazmid DNS nagy mennyiségű készítését Boyant festék sűrűség gradiens centrifugálással hajtottuk végre Stougaard és Molin szerint (Anal. Biochem. 118, 1981, 181. oldal). A DNS-preparátumok poliakrilamid-gél elektroforézisét és agaróz gél elektroforézisét lényegében a Molin és Nordström által leírt módszerrel hajtottuk végre [Methods in Plasmid Biology, Odense University (Odense Egyetem) 1982]. A restrikciós endonukleázokat a gyártó által nyújtott előírásokkal összhangban használtuk (Boehringer, Mannheim vagy Biolabs, New England) 37 °C hőmérsékleten. Kétszeres és háromszoros emésztést, azzal az enzimmel kezdtük, amely a legkisebb sókoncentrációt igényli, majd további pufferrel végeztünk beállitást, mielőtt a kővetkező enzimet hozzáadtuk volna. A Bal 31 exonukleázzal történő kezelést a következőképpen hajtottuk végre; 0,1 egység Bal 31-et adtunk 50 pg lineáris DNS-hez, és mintákat vettünk ki az 1., 2., 4., 8., 16., 32. és 60. percben 60 mmól/literes EDTA-hoz, fenollal extraháltuk, etanollal kicsaptuk, éB újra szuszpendáltuk 20 pl TE pufferban. A 20 pl felét a megfelelő restrikciós enzimmel emésztettük, és agaróz gél elektroforézisnek vetettük alá, hogy meghatározzuk a törölt DNS-törlések átlagos méretét. A másik feléhez a megfelelő kapcsolót (linkért) adtuk hozzá, és a keveréket összekapcsoltuk (ligáltuk) 48 órán át a fölös mennyiségű T4 DNS ligázzal. A hasított polazmid DNS összkapcsolását a gyártó által ajánlott módszerrel hajtottuk végre a tompa vég-kapcsolás kivételével, ahol a T4 DNS ligáz és ATP feleslegét adagoltuk. Mikrobiológiai módszerek I. megosztási vizsgálat: A Lac* vektorok megalkotása lehetővé tette a plazmid Par* fenotípusának meghatározását egyszerűen szélesztve nem-szelektív McConkey laktóz lemezen vagy X-Gal lemezen. Az ezeket a plazmidokat befogadó baktériumok (alac) Lac* fenotípust közvetítenek, amelyet könnyen lehet jelezni színes telepként az indikátor lemezen, míg a plazmidmentes sejtek Lac* fenotipusúak és színtelen telepekként jelennek meg. II. megosztási vizsgálat (Lac* plazmidokhoz használt): Egy szelektív lemezről (antibiotikumot tartalmazó lemez) egy telepet szélesztettünk egy másik szelektív lemezre. Erről a lemezről egy telepet szélesztettünk egy LA lemezre, úgy, hogy egyedi telepek képződjenek. Az LA lemezről mintegy 10 telepet szuszpendáltunk 1 ml 0,9%-os NaC] oldatban 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
