201350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazmidok stabilizálására
9 HU 201350 B Ezeket a mérhető LF-értékeket akkor lehet hasznosítani, amikor bármely fentebb meghatározott típusú plazmidot vektorként alkalmazunk géntermékek előállításában, és ezek legalább egy olyan gént tartalmaznak, amely a plazmiddal természet szerint nem rokon. A találmány egy további tárgya tehát egy géntermék előállításának eljárása plazmid DNS-ról, amely szerint egy, a fentebb leírt jellemzők bármelyikével bíró par-stabilizált 10 plazmidot befogadó baktériumot tenyésztünk, és a plazmid géntermékét a baktériumtenyészetból kinyerjük. A tenyésztést önmagában ismert módon végezzük, beleértve a hagyományos tápközegeket, amelyek optimálisak a 15 szóban forgó baktériumfaj számára. Érdemes megjegyezni, hogy a stabilizálás következtében nincs szükség speciális tápközeg-összetételre. A géntermék kinyerése szintén jól ismert módszerekkel történik, amelyeket a 20 szóban forgó, elkészített géntermékekhez és tulajdonságaihoz, a gazdabaktérium tulajdonságaihoz, stb.-hez igazítunk. A tenyésztést legalább 100 baktériumgeneráción át folytatjuk, nagy mennyiségű termelésnél a sejtge- 25 nerációk száma, amely szükséges a baktériumok szaporításához, meghaladhatja a 100 generációt. Ilyen körülmények között a plazmid LF értékét úgy lehet megválasztani a benne levő par terület segítségével, hogy a plaz- 30 mid-veszteség kevesebb legyen, mint 2 ■ • 10-Vsejt/generáció. Ezt az LF értéket általában el lehet érni egyetlen par területtel is. Bizonyos esetekben azonban előnyös kevesebb, mint 10~5/sejt/generáció, még elónyő- 35 sebb kevesebb, mint 5 • 10~®(sejt)generáció LF értéket beállítani. Bár ezeket a nagyon kis LF értékeket bizonyos esetekben el lehet érni csak egyetlen par terület beiktatásával (elsősorban RÍ 40 par B területtel), mégis általában szükséges mindkét RÍ par terület jelenléte. A találmány egy további tárgya eljárás olyan baktériumok előállítására, amelyek a fentebb meghatározott típusú plazmidokat 45 tartalmazzák. A találmány szerinti plazmidok különleges előnye, hogy nem szükséges különleges mutánsok vagy törzsek a plazmid fenntartásának biztosítására. így bármilyen ilyen plazmidot befogadni képes baktériumfaj 50 és törzs alkalmazható, mint pl. gram-negatív baktériumok. A találmány szerinti eljárásban alkamazható olyan baktérium, amelyben a plazmidok szaporodni é6 stabilitásukat fenntartani képesek, például az Escherichia coli. Végül a találmány tárgya eljárás olyan DNS fragmens előállítására, amely fő komponensként egy RÍ par területet tartalmaz. Ez azt jelenti, hogy lényegileg minden DNS fragmens, amely be van iktatva a gazda- 60 -plazmidba, valamelyik vagy mindkét par területet tartalmazza, és a DNS többi része azt a célt szolgálja, hogy alkalmas restrikciós helyeket szolgáltasson a befogadó plazmidon levő megfelelő restrikciós helynél történő be- 65 iktatáshoz. Az RÍ par A és RÍ par B területet tartalmazó, beiktatott DNS fragmens hoszsza - ezzel az elvvel összhagban - nem haladhatja meg a kb. 6 kb hosszúságot, elő- 5 nyösen a kb. 4 kb hosszúságot, és még előnyösebben a 3 kb hosszúságot. Amikor a DNS fragmens az RÍ par A területet foglalja magában, ez normálisan nem haladja meg a kb. 4 kb hosszúságot, előnyösen a kb. 2,5 kb hosszúságot, és különösen előnyösen a kb. 2 kb hosszúságot. Amikor a DNS fragmens az RÍ par B területet foglalja magában, ez normálisan nem haladja meg a kb. 2 kb hosszúságot, előnyösen a kb. 1,5 kb hosszúságot, és különösen előnyösen a kb. 1 kb hosszúságot. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy az ilyen kicsiny és ennélfogva könnyen beiktatható DNS fragmensek megőrzik stabilizáló funkciójukat akkor is, amikor a restrikciós enzimes térképezéssel a par A terület egy kb. 1800 bp (bázispár) területre szűkül és a par B terület kb. 900 bp-re szűkül. Lehetséges, hogy a Par* fenotípust ténylegesen szolgáló gén vagy gének még ennél is kisebbek. A Par* fenotípussal rendelkező hibrid plazmidok megalkotásában komoly problémát jelent az ilyen fenotipusra történő átvizsgálás gyors és egyszerű módszerének hiánya. Általában az alkalmas hibrid-plazmidot a Par* fenotípussal lehet azonosítani, amely a plazmid nagy stabilitását eredményezi a plazmid szelekciós kényszer nélküli növekedése során. Az ilyen típusú átvizsgálás azonban hosszadalmas, és csak akkor helytálló, ha a szülő plazmid nem stabilan öröklődött. Egy másik átvizsgálási módszert fejlesztettünk ki, amelyet az alábbiakban ismertetünk: a.) Átvizsgálás a par A fragmens beiktatására nézve. Ha ugyanabban a sejtben két különböző, (össze nem férő csoportokból származó), plazmid van jelen, amelyek mindegyike hordoz par A* területet, ezek kiűzik egymást egy bizonyos gyakorisággal (összeférhetetlenség), valószínűleg azért, mert ezek versengenek a sejtben levő megosztási apparátusért. Az ilyen par által közvetített összeférhetetlenségi fenotipus-fajtát a par hibridek átvizsgálásához lehet hasznosítani. így pl. egy Par A* plazmidot ét lehet vinni egy olyan alac E. coli törzsbe (pl. CSH 50 törzsbe), amely más olyan plazmidot is tartalmaz, 55 amely lac géneket és a par A* területet hordozzák. Normálisan a belépő plazmid par* által közvetített összeférhetetlenséget fejt ki a bent lévő Par A* plazmid ellen. A bent levő plazmid Lac* fenotipusa miatt az ilyen összeférhetetlenség könnyen kimutatható, ha a transzformónsokat csak a belépő plazmidban talált rezisztencia-marker alapján szelektáljuk, míg a bent levő plazmid jelenléte vagy távolléte jelezhető egy indikátor szubsztrátumon, pl. McConkey laktóz lemezen. Az ilyen 10 7
