201350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazmidok stabilizálására
1 HU 201350 B 2 A találmány tárgya eljárás a gének és termékeik előállításához alkalmazott rekombináns DNS technológia területén használatos plazmidok stabilizálására. A legtöbb természetes plazmid folyamatos fenntartása, még szelekciós kényszer hiányában is (azaz olyan tényezők hiányában, amelyek csak azoknak az organizmusoknak a növekedését teszik lehetővé, amelyek magukba foglalják a plazmidot; erre példa egy antibiotikum a tápközegben olyan plazmid esetében, amely az illető antibiotikum-rezisztenciát közvetítő gént hordozza) azt sugallja, hogy a plazmid-fenntartási funkciók úgy fejlődtek ki, hogy biztosítsák ezeknek az extrakromoszomális elemeknek a folyamatos jelenlétét nagy hatékonysággal. A plazmid-fenntartási funkciók elsődlegesen a gének replikációjából állnak, beleértve ezek szabályozó köreit is, amelyek szabályozzák a plazmid koncentrációját a sejtben. A növekvő sejtekben a replikációs szabályozó rendszer a plazmid-kópiák számától függően a plazmid-replikáció valószínűségének növelésével vagy csökkentésével helyreállítja az átlagtól való eltéréseket. Nincs azonban olyan szabályozó rendszer, amely meg tudná akadályozni olyan sejtek előfordulását, amelyekben nagyon kevés vagy éppen csak egy plazmid van, és nyilvánvaló, hogy ilyen sejtekből vagy lehetőség arra is, hogy plazmidmentes leánysejt képződjék. Ez a probléma természetesen a kis kópiaszámú plazmidoknál a legnagyobb. Sőt, a plazmidmolekulák passzív eloszlása a sejtosztódásnál szükségszerűen eredményez bizonyos gyakorisággal plazmidmentes sejteket. Mivel a plazmidmolekula elvesztése a sejtből irreverzibilis, egy ilyen nem-stabil szituáció következménye az lesz, hogy a teljes populáció végül is plazmidmentessé válik. A plazmidok sejtosztódásnál történő véletlenszerű eloszlása mellett más tényezők is befolyásolhatják a plazmidok elvesztésének arányát a plazmid fenntartásához szolgáló, szelekció hiányában nőtt sejtek tenyészetéből. így pl. néhány plazmid speciális rekombinációs rendszert igényel abból a célból, hogy a két újonnan replikáit molekula szétváljon (Austin és munkatársai, Cell, 25, 1981, 729-36 oldal). A szétválás hiányában multimerek képződnek (egymásba kapcsoltak), és ilyen módon a leánysejtekké osztódás szintjén még egy nagy kópiaszámú plazmid is úgy tűnhet, mint egy kis kópiaszámú plazmid, mivel a plazmidmentes sejtek keletkezésének valószínűsége növekszik a multimer szerkezetben egymásba kapcsolt plazmidmolekulák számának növekedésével. Egy másik jelenség, amelyet gyakran meg lehet figyelni a rekombináns DNS technológiában, egy stabil klónozó vektor átalakulása nem-stabil hibrid vektorrá, egy DNS fragmens beiktatásának eredményeképpen, amelynek jelenléte vagy csökkenést okoz a plazmid kópiaszámában, vagy egy sérült terméket szolgáltat, amely negatívan hat a sejtnövekedésre. Minden ilyen esetben a plazmid kiválása és elvesztése egy bizonyos (kisebb vagy nagyobb) gyakorisággal történik, amelyet nem könnyű kívülről befolyásolni. A természetes plazmidok stabilitása, különösen a kis kópiaszámú plazmidoké, azt sugallja, hogy a replikációs szabályozó rendszeren kívül a fenntartási funkciók egy második sorozata is létezik, amely aktívan részt vesz a plazmidmolekulák rendezett elosztásában a sejtosztódásnál. Az ilyen funkciókat megosztási funkcióknak nevezzük, és tanulmányok (pl. Meacock és munkatársai: Cell 20, 1980, 529-42 oldal; Nordstróm és munkatársai: Plasmid, 4, 1980, 332-49 oldal, Seelke és munkatársai: Plasmid, 7, 1982, 163-79 oldal) már rámutattak, hogy ezeket legalábbis részben maguk a plazmidok kódolják (.par' területekben). így bizonyos plazmid-hiányos mutánsok elvesztették stabil fenntarthatóságukat vagy öröklődésüket annak ellenére, hogy normál vadtípusú viselkedést mutatnak, jelezve, hogy egy plazmid-fajlagos funkció, amely a stabilitást biztosítja, kiiktatódott (lásd Nordstrom és munkatársai fentebb idézett munkáját). Mivel sok a rekombináns DNS technológiában vektorként alkalmazott plazmid nagy mennyiségű DNS-t vészit a vad típusú szülö-plazmidokhoz viszonyítva, ezek hajlamosak a nem-stabil öröklődésre. Ez komoly problémát vet fel, mivel a plazmid instabilitása végül is a plazmid teljes elvesztését eredményezi a sejtekből, ami csökkenti a plazmiddal kódolt géntermékek relatív kitermelését. Ez a probléma különösen jelentős a géntermékek nagy mennyiségű termelésénél, ahol a mikroorganizmusok növekedése szelekciós kényszer, pl. egy antibiotikum, mellett nem vihető keresztül, de gyakran környezeti szempontokból legalábbis nem kívánatos, és ahol a mikroorganizmusok generációk nagy számán keresztül növekednek. Az olyan vektorok, amelyek sejtenként csak néhány kópiában vannak jelen, a legvalószínűbb, hogy nem stabilan öröklődnek és ezért eltűnnek a sejtből. Még azokról a plazmidokról is ismeretes, amelyek szokásosan viszonylag nagy kópiaszámúak a plazmidnak viszonylag jó stabilitást biztosítva, hogy nem-stabillá válnak, amikor a plazmiddal természet szerint nem rokon gént hordozó DNS fragmenseket iktatnak beléjük. A jelen találmány tárgyát olyan plazmidok képezik, amelyek a plazmiddal természet szerint nem rokon beiktatott gént vagy géneket hordoznak, és amelyek ezen túl egy olyan beiktatott gént is hordoznak, amely megosztási funkciókat lát el. A .beiktatott’ kifejezés azt jelenti, hogy a gén(ek)et vagy DNS fragmenst a végső plazmid kialakítása valamely szakaszában vezetjük be a plazmidba. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
