201296. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-szubsztituált-1-(alkil-amino)-2-propanolok sztereospecifikus előállítására
HU 201296 8 monas oleovorans ATCC 29347-tel [4-(2,3-epoxipropoxi)-fenilj-acetamiddá. Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 szuszpenziót készítünk (0,75% glicerint és 0,05% dietoxi-metánt tartalmazó PSX ásványi sós táptalajban 7 pH-nál 30 °C-on 24 óra hosszat tenyésztett) sejtek 7,5 pH-nál az eredeti sejttenyészet térfogata egytizedének megfelelő térfogatú PSX táptalajban való reszuszpendálásával. 10 ml (12,6 g/liter szárazsúly) sejtszuszpenziót egy 250 ml-es ledugaszolt Erlehmeyer-lombikban vízmentes körkörös rázógépen 30 °C-on inkubálunk 0,5 ml 90 mg/ml töménységű golyósmalomban őrölt és ultrahanggal homogenizált (4-allil-oxi-fenil)-acetamid szuszpenzióval, amely még 50 mg/ml Tween 80-at is tartalmaz. 1 ml-es mintákat 2 ml diklór-metánnal extrahálunk, az oldószert eldesztidáljuk, majd a maradékot a [9. példában a [4-(2,3- epoxi-propoxi)-feniI]-acetamid analízisére leírt körülmények között végzett] nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás analízis előtt dimetil-formamidban oldjuk. Az inkubációs elegybe a [4-(2,3- cpoxi-propoxi)-fenil]-acetamid szintje 0,9 g/liter, illetve 1,3 g/liter 3 óra, illetve 24 óra inkubálás után. 11. példa (4-Allil-oxi-feail)-acetamid átalakítása Pseudomonas aeruginosa NCIB 12036-tal, Pseudomonas aeruginosa NCIB 8704-gyel és Pseudomonas putida NCIB 9571-gyel [4-(2,3-epoxi-propoxi)-fenil]acetamiddá. Pseudomonas aeruginosa NCIB 12036, Pseudomonas aeruginosa NCIB 8704 és Pseudomonas putida NCIB 9571 sejtszuszpenziókat készítünk (0,75% nátrium-laktátot és 0,05% dietoxd-metánt tartalmazó PSX ásványi savas táptalajon, 7 pH-n, 30 °C-on 24 óra hosszat tenyésztett) sejteknek az eredeti sejttenyészet térfogata egytizedének megfelelő térfogatú 7,5 pH-jú PSX-táptalajban való reszuszpendálásával. 10 ml sejtszuszpenziót vízszintes körkörös rázógépen 250 ml-es ledugaszolt Erlenmeyer-lombikban 0,5 ml 10%-os töménységű golyósmalomban őrölt (2-allil-oxi-fenii)-acetamid szuszpenzióval (amely még 5% Tween 80-at is tartalmaz) 30 °C-on inkubálunk. Az. inkubációs elegyeket 24 óra múlva diklór-metánnal extraháljuk. Az inkubációs elegyekel 24 óra múlva diklór-metánnal extraháljuk, és a következő [4-(2,3-epoxi-propoxi)-fenil]-acetamid koncentrációkat találjuk: Pseudomonas aeruginosa NCIB 12036-nál 0,07 g/liter; Pseudomonas aeruginosa NCIB 8704-nél 6,08 g/liter; Pseudomonas putida NCIB 9571-nél 0,19 g/liter (analízis nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával, mint az előbbi példákban). 12. példa Allil-f4-(2-metoxi-etiI)-fenil]-éter átalakítása glicidil-[4-(2-mctoxi-ctil)-fenilj-éterré Pseudomonas oleovorans ATCC 29347-tel. Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 szuszpenziót készítünk (0,075% glicerint és 0,05% dietoxi-metánt tartalmazó 7 pH-jú PSX ásványi sós táptalajon 30 °C-on állandó fázisig tenyésztett) sejteknek az eredeti sejttenyészet térfogata egytizedének megfelelő térfogatú 7,5 pH-jú PSX táptalajban való reszuszpendálásával. Egy 250 ml-es Erlenmeyer lombikban 10 ml (12,6 g/liter szárazsúlyú) sejtszuszpenziót inkubálunk vízszintes körkörös rázógépen 37 °C-on 250 pl allil-[4-(2-metoxi-etil)-feniIJ-éterrel és 50 ml glükózzal. A glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éter képződését diklór-metánnal végzett extrakció után gázkromatográfiával követjük nyomon (az előbbi példákban leírt körülmények között). Az inkubációs elegyben a glicidil-[4-(2-metoxi-etiI)-fenil]-éter koncentrációja hat óra múlva 7,30 g/liter. 13. példa 4-(2-CikIopropil-metoxi-etil)-feml-allil-éter átalakítása Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 törzzsel ( + )-4-(2-ciklopropil-metoxi-etil)-fenilglicidil-éterré Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 0,5 g/1 dietoxi-metánt tartalmazó, 100 ml PSX ásványi sós közegben (pH = 7,0) 7,5 g/1 glicerinen 30 °C-on tenyésztett 24 órás biomasszáját 10 ml PSX közeget (pH = 7,5), 5 g/1 glükózt és 25 g/14-(2-ciklopropilmetoxi-etil)-allil-étert tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba töltjük. A lombik tartalmát 30 °C- on körkörös rázógépen inkubáljuk, és mintákat veszünk, amelyeket diklór-metánnal való extrahálás után Varian 3400 gázkromatográfon analizálunk (oszlop: 3% OVI WHP 100-120-on; 50 cm hossz; 2 mm átmérő; 100—tói 170 °C-ig 10 °C/perc; N2 30 ml/perc). PSX közeg: 8,92 g/I kálium-dihidrogén-foszfát, 2,94 g/1 dinátrium-hídrogén-foszfát, 1,0 g/1 diammónium-hidrogén-foszfát, 0,2 g/1 aminónium-szulfát, 1,0 g/1 diammónium-hidrogén-foszfát, 0,2 g/1 ammónium-szulfát, 0,2 g/1 kálium-klorid, 0,294 g/1 trinátrium-citrát, 0,005 g/1 kalcium-szulfát-dihidrát, 0,2 g/1 magnézium-szulfát-heptahidrát és 10 ml/1 PS II nyomelem oldat (PS II nyomelem oldat összetétele: 0,25 g/1 ammónium-szulfát-vas-szulfáthexahidrát, 0,05 g/1 cink-szulfát-heptahidrát, 0,03 g/1 mangán-klorid-tetrahidrát, 0,015 g/1 réz-szulfátpentahidrát, 0,015 g/1 kobalt-klorid-hexahidrát, 0,005 g/1 bórsav, 0,0055 g/1 bórsav, 0,0055 g/1 nátrium-moübdenát-dihidrát, 0,01 gl kálium-jodid és 3 pH-ig sósav). A (+)-4-(2-ciklopropil-metoxi-etil)-fenil-gíicidil-éter termék három órás inkubálás után jelenik meg, és 24 óra alatt 3,03 g/1 koncentrációra dúsul. Megfelelő mennyiségű (+ )-4-(2-ciklopropilmetoxi-etil)-fenil-glicidil-éter feldúsítására az előbb leírt körülmények között hat óra hosszat, de 37 °C-on inkubált 10X10 ml-es tenyészeteket 500 ml diklór-metánnal extraháljuk. A kivonatot nátriumszulfáton szárítjuk, az oldószert elpárologtatjuk, és az epoxidot kovasavgélen hexán és éter elegyével gradiens eluálással (az epoxid 45-60% éterrel eluálható) tisztítva 188 mg ( +)-4-(2-ciklopropil-metoxi-etil)-fenil-glicidil-étert kapunk, [a] d = +1,8° (c = 1,0, kloroformban). A termék PMR spektruma megfelel a kívánt szerkezetnek, és azonos a kémiai szintézissel előállított 4-(2-ciklopropil-metoxi-etil)-fenil-glicldiléter spektrumával. A termék optikai tisztaságát enantiomerjeinek 14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
