201296. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-szubsztituált-1-(alkil-amino)-2-propanolok sztereospecifikus előállítására
HU 201296 B 9 10 Pseudomonas putida NCIB 9571 sejtszuszpenziót 1 g allil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éterrel 30 °C-on 24 óra hosszat inkubálunk, utána diklór-metánnal extraháljuk, és (a 3. példában leírtak szerint) tisztítás után 324 mg ( + )-gUddil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]étert kapunk; [afő = +6,42° (c «* 0,88; etanol). Az Eu(hfc)3 európium shift-reagens jelenlétében (az 1. példa szerint) protonmágneses rezonanciapsektroszkópiával mért optikai tisztaság 100% a protonmágneses rezonanciaspektroszkópiás mérések kísérleti hibáin belül. 214 mg ( + )-glicidil-[4-(2-metoxi-etil-feml]étert (a 2. példában leírtak szerint) izopropil-aminnal kondenzálva 146 mg (-)-metoprololt kapunk, amelynek olvadáspontja 44-46 °C, [aj D = -5,00° (c = 1,01; etanol). Az optikai tisztaság (a 2. példában leírt módszer szerint) 98%-nak bizonyul. Az anyalúg bepárlásával 9 mg 97,5%-os optikai tisztaságú (-)-metoprololt kapunk. A glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éternek megfelelő csúcsokat az egyes esetekben meghatározva a következő konverziókat az egyes esetekben meghatározva a következő konverziókat kapjuk: Myco- 5 bacterium rhodochrous 24 óra múlva 2%; Rhodococcus sp. 96 óra múlva 1% és Nocardia corallina 96 óra múlva 5%. A szerkezet további bizonyítását úgy kapjuk, hogy egy Nocardia corallina felhasználásával (500 10 ml tenyészet, körülmények az előbbiek) végzett pontosan bemért kísérleti tenyészetet diklór-metánnal extrahálunk, majd szilikagélen tisztítjuk, és protonmágneses rezonanciaspektroszkópiával analizáljuk. A glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éter 15 európium shift-reagens jelenlétében felvett protonmágneses rezonanciaspektruma 100%-os optikai tisztaságot bizonyít, és azonos a Rhodococcus equivel kapott ( + )-glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]éter európium shift-reagenssel felvett protonmág- 20 neses rezonanciaspektrumával. 6. példa Allil-[4-(2-metoxi-etiI)-fenil]-éter átalakítása. Pseudomonas oleovorans ATCC 29347-tel ( + )glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éterré, majd ennek 25 átalakítása (-)-metoprolollá. 200 ml Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 sejtszuszpenziót (amelyet a 3. példában leírtak szerint készítünk) 2 g allil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]éterrel 30 °C-on 5 óra hosszat inkubálunk. Diklór- 30 metánnal végzett extrakció és szilikagélen (az 1. példa szerint) végzett extrakció és szilikagélen (az 1. példa szerint) végzett tisztítás után 289 mg ( + )glicil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil)-étert kapunk; [a] d = +8,02° (c = 1,16; etanol). Az Eu(hfc)3 európi- 35 um shift-reagens jelenlétében (az 1. példa szerint) protonmágneses rezonanciaspektroszkópiával mért optikai tisztaság a protonmágneses rezonanciaspektroszkópiás mérések kísérleti hibáin belül 100%. 40 171 mg ( + )-glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]étert (a 2. példában leírtak szerinti módszerrel) izopropil-aminnal reagáltatva 154 mg 44-45 °C olvadáspontú (-)-metoprololt kapunk; [a] d = - 5,27° (c = 0,967; etanol). Az optikai tisztaság az 45 S-leucil-diasztereomer-származékok (2. példa szerinti) nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás vizsgálata alapján 98,4%. Az anyalúg bepárlásával 6 mg 92,2%-os optikai tisztaságú (-)-metoprololt kapunk. 50 7. példa Allil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éter mikrobiológiai átalakítása ( + )-glicil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]éterré. 55 50 ml ásványi sós táptalaj, 0,05 ml Tween 80,0,05 ml tetradekán és 0,05 ml allil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éter elegyét inkubáljuk vagy Nocardia corallina ATCC 3133o-cal vagy Rhodococcus sp. NCIB 11277-tel vagy Mycobacterium rhodochrous NCIB 60 9703-mai (melyeket előtte 72 óra hosszat 0,5% tetradekáno.i tenyésztünk), majd 30 °C-on inkubáljuk. Mintákat veszünk 24 óra és 96 óra után, diklór-metánnal extraháljuk, és gázkromatográfiával (GC) analizáljuk. 65 8. példa Allil-fenil-éter átalakítása Mycobacterium NCIB 11626-tal (+ )-fenil-glicidil-éterré, majd ennek átalakítása (-)-3-fenoxi-l-(izopropiI-amino)-2- propanollá. Folytonos tenyésztési körülmények: 2,7 literes tenyészet-térfogat; AM2 táptalaj [amely 1,45 g/liter ammónium-szulfátot, 1,0 g/liter foszforsavat, 0,099 g/liter magnézium-szulfát-heptahidrátot, 0,015 g/liter kalcium-klorid-dihidrátot, 2 ml/liter TK3 nyomelem-oldatot, 1 ml/liter 0,1 mólos vas(Il)-szulfátheptahidrát oldatot tartalmaz]; szénforrás; 25 ml/perc etilén; levegő; 300 ml/perc; keverő sebessége: 280 ford/perc; hőmérséklet: 28 °C; pH = 6,8; hígítási sebesség: 0,02/óra (gmax = kb. 0,03/óra). Ezek a körülmények körülbelül 3,2 g/liter szárazsúly biomassza szintet biztosítanak. A sejteket felhasználás előtt általában centrifugálással koncentráljuk, majd a megadott közegben reszuszpendáljuk. A fenil-glicidil-étert gázkromatográfiával analizáljuk (oszlop és körülmények az előbbi példában megadottakkal azonosak, azzal az eltéréssel, hogy a hőmérséklet-program 50 °C - 100 °C-ig 10 °C/perc-nél). Egy 2,25 literes térfogatú kétfázisú rendszert használunk a fenil-glicidil-éter előállításához. Az átalakítást 750 ml sejtszuszpenzióval (6,9 g/liter szárazsúly) és 1500 ml 2,5 térf. = térf.% allil-fenilétert tartalmazó izooktánnal töltött fermentorban hajtjuk végre (lásd 4. ábra). Az epoxid 193 p.mól/óra/g száraz súly (0,03 g/óra/g száraz súly) sebességgel termelődik, és 10 óra múlva szilikagélen végzett kromatográfiával különítjük el, majd desztillációval tisztítva 750 mg ( + )-fenil-glicidilétert kapunk. A mikrobiológiai úton előállított ( + )-fenil-glicidil-éter protonmágneses rezonanciaspektruma és tömegspektruma egyezik a megfelelő szerkezettel, és azonos fenil-allil-éter m-klór-perbenzoesawal való reagáltatásával kémiai úton előállított (±)-fenil-glicidil-éter spektrumával. A (+ )-fenil-glicidiléter fajlagos forgatóképessége: [a] d = +11,38° (c = 1,09; etanol). 6
