201119. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kedarcidin és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
19 HU 201119 B 20 lévő 100 ml steril táptalajra visszük át, melynek összetétele: cerelóz (Corn Products) 30 g Pharmamedia (Traders Oil Mill Co.) 10 g Nutrisoy (Arches Daniels Midland Co.) 10 g kalcium-karbonát 3 g deszt. vízzel feltöltve 1 literre A vegetatív tenyészetet 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk 72 órán át percenként 250 fordulatszámú körkörös rázógépen. 2. példa Fermentálás rázott lombikban Az 1. példában leírtak szerint előállított vegetatív tenyészet 5 milliliterével beoltunk egy 500 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő 100 ml táptalajt, melynek összetétele a kővetkező: glicerin 30 g Pharmamedia 10 g Distiller’s solubles (Nutrition Product Co.) 15 g halliszt (Menhaden) 10 g kalcium-karbonát 6 g deszt. vízzel feltöltve 1 literre. A tenyészetet 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk percenként 250 fordulatszámú körkörös rázógépen. Az antibiotikum fehérje termelődését mikrobiális úton követjük nyomon B. subtilis tesztorganizmust használva és in vitro citotoxikus vizsgálatokkal egér és patkány melanoma B16-F10 sejteket és humán tumorsejteket alkalmazva. A termelés optimuma általában a 144-168. órában érhető el. 3 3. példa Tankférmén táció Az 1. példában leírtak szerint előállított vegetatív tenyészet 25 milliliterével beoltunk egy 2 literes Vitro edényben lévő 500 ml táptalajt, melynek összetétele azonos a vegetativ tenyészet közegével. Ezt a tenyészetet 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk 72 órán át körkörös zárógépen, melynek percenkénti fordulatszáma: 250. A második lépéses oldótenyészettel (500 ml) beoltunk egy 16 liter névleges térfogatú New Brunswick Microgen fermentorban lévő 10 liter termelő táptalajt, melynek összetétele azonos a 2. példában megadott táptalajéval. A fermentálás 28 °C hőmérsékleten történik, percenként egy térfogatnyi levegővel levegőztetünk (fermentortérfogatra számítva), a kevertetés percenkénti fordulatszáma 250. A kedarcidin antibiotikum termelődését in vitro biológiai értékméréssel követjük nyomon. 12 4. példa A kedarcidin kinyerése és tisztítása 10 liter fermentlevet összekeverünk 6 liter Dicalite-val és a hig szuszpenziót Dicalite szűrőrétegen átszűrjük. A kiszűrt anyagot eldobjuk, a szűrletet Zeta Prep 250 QAE ioncserélő kész oszlopra (LKB-Produkter AB, Svédország) visszük 30 ml/perc átfolyási sebességgel. Az oszlopot előzőleg 2 liter 50 mM trisz-HCl pufferral, pH = 7,4, telítettük. Az eluátumot összegyűjtjük. Az oszlopot 1 liter 50 mM trisz-HCl pufferrel pH =7,4 mossuk, majd 0,5 mól nátrium-kloridot tartalmazó 500 ml 50 mM trisz-HCl pufferrel, pH = = 7,4, eluélunk. Az eluátumot összegyűjtjük 500 ml-ről 100 ml-re töményítjük Amicon ultraszűrő cellában Amicon YM5 membránt használva. A betöményitett oldatot gélszürésnek vetjük alá. 5 x 100 cm méretű oszlopot 1400 ml 50 mM trisz-HCl pufferben lévő azonos térfogatú Ultrogel AcA54 (LKB-Produkter AB, Sweden) gyantával töltünk meg. Az ultragel ágyat 5 liter 50 mM trisz-HCl pufferrel, pH = 7,4, hozzuk egyensúlyba. Az anyag rávitele után az oszlopot 2 liter 50 mM trisz-HC1 pufferrel, pH = 7,4, eluáljuk 60 ml/perc átfolyási sebesség mellett. 450 ml kezdeti frakció után 10 milliliteres frakciókat gyűjtünk és valamennyit megvizsgáljuk a B. subtilis tesztorganizmussal szemben. A gátlás zónákat adó frakciókat (83-133 frakció) egyesítjük és ultraszűréssel 100 ml-re betöményitjük. A betöményitett oldatot ioncserélő oszlopra visszük, melyet előzőleg úgy készítünk el, hogy a 2,5 x 15 cm méretű oszlopba 70 ml 50 mM trisz-HCl pufferben 70 DEAE Trisacryl gyantát (LKB-Produkter AB, Svédország) töltünk. A Trisacryl ágyat tízszeres oszloptérfogatú 50 mM trisz-HC1 pufferrel kiegyenlítjük. A tisztítandó anyag felvitele után az elúciót tízszeres oszloptérfogatnyi 50 mM trisz-HCl pufferrel kezdjük, majd grádienselúcióval folytatjuk. Ehhez 300 ml össztérfogat eluenst használunk. A lineáris grádienselúció kezdeti oldata; 50 mM trisz-HCl puffer; a befejező eluens: 50 mM trisz-HCl puffer, mely 0,5 M nátríum-jdoridot tartalmaz. A sókoncentráció változásának sebessége: 0,1 M/óra; az áramlási sebesség: 60 ml/óra. Összesen 47 db 5 ml-es frakciót gyűjtünk, a frakciókat B. subtilis-szel vizsgáljuk. Az aktív 25-37. frakciókat egyesítjük és analitikai gélszűréses HPLC-nek vetjük alá. Waters Protein Analysis 1-125 oszlopot használva; az eluens 0,2 M trisz-acetát, pH = 7,0; átfolyási sebesség 1 ml/perc; detektálás 260 nm UV fényen. Az adott körülmények között egyetlen csúcs jelenik meg a kromatogramon 8,3 perces retenciós idővel. Az összegyűjtött frakciók egyneműségét izoelektromos fókuszálási módszerrel és SDS-PAGE módszerrel is . igazoljuk az előzőekben már ismertetett eljárások szerint. Fagyasztva szárítással - a puffer töme-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
