201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
7 HU 201115 B 8 Ami az élesztőben használható szelektív markergéneket illeti, bármely olyan marker -gént használhatunk, mely a marker fenotípusos kifejeződése révén megkönnyíti a transzformánsok szelekcióját. Az élesztőben használható gének közül különösen az antibiotikum-rezisztencia gének megfelelőek, vagy éleszlóauxotróf mutánsok esetében a gazdaszervezet hibáit javító gének. Az említett gének pédául rezisztenssé teszik az élesztósejteket cikloheximidre, vagy prototróffá tesznek egy auxotról élesztőmutánst, például egy URA3, LEU2, IÍIS3 vagy TRP1 gént hordozó sejtet. Az is lehetséges, hogy markerkónt olyan struktúrgéneket használjunk, melyek egy autonóm replikálódó szakaszhoz vannak kötve, azzal a feltétellel, hogy a transzformálandó gazdaszervezet auxotróf legyen a marker -génről kifejeződő termékre. A találmány szerinti hibrid-vektorok előnyösen olyan további DNS-szakaszokat is tartalmaznak, melyek egy bakteriális gazda, főleg Escherichia coli, replikációs origóját és egy szelektív genetikai markerét is hordozzák. Az Escerichia coli replikációs origo és egy Escerichia coli marker jelenléte egy élesztő hibrid-vektorban előnyös tulajdonságokat kölcsönöz annak. Először, nagy inenynyiségü hibrid-vektor DNS állítható elő Escherichia coli növesztésével és amplifikálásával, és másodszor a hibrid-vektorok összeillesztését kényelmesen megtehetjük Escherichia coli-ban felhasználva az Escerichia coli-ra alapozott klónozási technológia teljes repertoárját. Az Escherichia coli plazmidok, úgymint a pBR322 és hasonlók, mind Escherichia coli replikációs origót, mind Eschrichia coli- ban megnyilvánuló antibiotikum rezisztenciát, hordoznak, ezáltal előnyösen használhatók élesztő hibrid-vektorok részeként. A jelen találmány szerinti hibrid-vektorok előnyösen egy élesztögén 3’ végét is tartalmazzák, melyekben a helyes transzkripciós terminációs jel és a poliadenilezés van kódolva. Megfelelő 3’ szakasz például az, amely a használt promoter génjéhez természetesen kapcsolódik, főleg a PH05 gén 3’ szakasza. Azt a DNS-szakaszt, amely például az élesztő- és baktérium-gazda replikációs origóját és genetikai markerét tartalmazza, a továbbiakban .vektor DNS'-ként említjük mely az élesztőpromoterrel és a TPA kódoló szakasszal együtt a találmány szerinti hibrid-vektort képezi. A jelen találmány tárgya olyan hibrid-vektorok, melyek az élesztő gazdasejtben képesek szaporodni és fenotipusos szelekciót biztosítani, élesztöpromotert és a szöveti plazminogén aktivátort kódoló DNS szakaszt tartalmazzák olyan pozícióban, hogy az említett DNS-szakaszhoz a transzkripciós start és stop-jelek valamint a transzlációs start és stop-jelek kapcsolódnak a hibrid-vektorban az említett promoter kontrollja alatt olyan módon, hogy egy transzformált élesztőtőrzsben az említett DNS szakasz kifejeződik és szöveti plazminogén aktivátor keletkezik. A hibrid-vektorokat a szakterületeken ismert módon állitjuk elő, például úgy, hogy a vektor DNS-be egy élesztöpromotert és az említett promoterrel kontrollált TPA-t kódoló szakaszt építünk be. Egy megfelelően feltérképezett lineáris vagy előnyösen cirkuláris, például baktérium plazmid DNS-t vagy hasonlót (lásd előzőekben) használhatunk, mely legalább egy restrikciós hellyel, előnyösen kettő vagy több restrikciós hellyel rendelkezik. A vektor DNS előnyösen már tartalmazza az élesztőés/vagy baktériumgazda replikációs origóját és genetikai markereit. A vektor DNS-t megfelelő restrikciós endonukleázzal hasítjuk. A hasított DNS-t az élesztöpromotert és a TPA-t kódoló szakaszt tartalmazó DNS-fragmenthez kötjük. A promoter és a TPA-t kódoló szakasz bekötése előtt vagy utón (vagy lehet egyidejűleg is) lehetséges az élesztő- vagy baktériumgazda replikációs origójának és/vagy genetikai jelzőgénjének beépítése is. Minden esetben úgy kell megválasztani a hasítási és összekapcsolási körülményeket, hogy ne keletkezzen zavar a vektor DNS és a promoter lényeges funkciójában. A hibrid vektort összerakhatjuk lépésenként, vagy két, az összes érdekes szakaszt tartalmazó szakasz összekötésével. Különböző technikákat használhatunk DNS szakaszok in vitro összekapcsolására. Tompavégű (végig bázispárokat tartalmazó DNS duplex), bizonyos restrikciós enzimekkel előállított DNS szakaszokat közvetlenül T4 DNS-ligázzal kapcsolhatjuk. Szokásosabb, ha a DNS szakaszokat egyszálú, tapadós végeken keresztül kötjük . össze, a kovalens kötést DNS-ligázzal, például T4 DNS-ligázzal hozva létre. Az ilyen egyszálas .tapadós vég'-eket a DNS-t egy másfajta, lépcsős végeket képező endonukleázokkal hasítva állítjuk elő (a DNS duplex két szálát különböző, egymástól néhány nukleotid távolságra levő pontokon hasítja az ilyen enzim). Egyes szálakat úgy is előállithatunk, hogy tompa vagy lépcsőzetes végekhez terminális transzferáz enzimmel építünk hozzá nukleotidokat (homopolimer toldás), vagy egy Lompavégű DNS-szakasz egyik szálát megfelelő exonukleázzal, például lambda-exonukleózzal visszaemésztjük. A lépcsős végek előállításának másik megközelítési módja, ha a tompavégű DNS-szakaszokhoz olyan, kémiailag szintetizált linker (kötő) DNS-t kötünk, mely egy lépcsős véget képező restrikciós endonukleáz felismerési helyét tartalmazza, és a kapott DNS-t a megfelelő endonukleázzal" emésztjük. Hogy megfelelően kifejeződjön, a TPA gént a transzkripciós (élesztő promoter) és transzlációs (riboszómális kötőhely) funk-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
