201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
43 11U 201115 B 44-t magas sótartlmú pufferral (1,5 M nátrium-klórid, 10 mM Tris-HCl pH8,0 és 1,0 mM EDTA) oldjuk le etanollal kicsapjuk, majd 0,2 mg/ml koncentrációban 10 mM TRIS (pH8,0) pufferban oldjuk. A DNS fragment 5 jelölése p31RLa. Az a)-f) reakciókat hasonló módon végezhetjük p31YL DNS-sel a p31RL DNS-helyett, így p31YLa DNS fragmentet kapunk. 10 g) A pW349F plazmid emésztése llall-gyel A pW349F plazmid a humán szövet-specifikus plazminogén aktivátor struktúrgénjét 15 tartalmazza a pBR322 plazmid PstI helyére klónozva (lásd 7c. példa) A plazmid DNS előállítására a pW349-tel transzformált E. coli 11B101 törzs egy telepével 100 ml 10 mg/1 koncentrációban tetracik- 20 lint tartalmazó LB táptalajt oltunk. A tenyészetet éjszakén ét 200/perc fordulatszémmal 37 °C-on rázatjuk. A plazmid előállítását a 2. példában leírt módon végezzük. 10 pg pW349 plazmid DNS-t 10 egység 25 Ball restrikciós endonukleázzal emésztünk 2 órán ét 37 °C-on, 200 pl, 6 mM Tris-HCl (pH7,5), 6 mM nétrium-klorid, 6 111M magnézium-klorid, 6 mM 2-merkapto-etanol és 0,1 mg/ml borjú szérum-albumin összetételű 30 pufferban. A teljes emésztődés megtörténte után az oldatot fenol-kloroformos extrakcióval fehérje-mentesítjük. A DNS-t etanollal kicsapjuk, majd 0,2 mg/ml koncentrációban 10 mM Tris (pH8,0) pufferban oldjuk. 35 Adott esetben Xhol linkért ligáivá a Ball-gyel emésztett DNS tompa végéhez a további munkában kényelmesen használható klónozó helyet kapunk. 40 h) A Ball-gyel hasított pW319F DNS emésztése BglII-vel 4 pg Ball-gyel hasított pW349F DNS-t BglII restrikciós endonukleázzal (Biolabs) 45 emésztünk a szállító előírásai szerint. Miután a teljes emésztés megtörtént a fehérjéket fe~ nolos-kloroformos extrakcióval eltávolítjuk. A DNS-t etanollal kicsapjuk és 0,2 mg/ml koncentrációban vízben oldjuk. 50 i) . A Klenow DNS polimeráz és Sí nukleáz limitált reakciója a BglII restrikciós helyen 55 4 pg Ball-gyel és BglI-vel hasított pW349F DNS-t 30 percig szobahőmérsékleten inkubálunk 100 pl, 60 TRIS-HC1 (pI17,5), 10 mM magnézium-klorid, 0,1 mM dATP, 0,1 mm dGTP, 8 egység Klenow DNS-polimeráz 60 összetételű oldatban. A reakciót EDTA-nak 10 mM végkoncentrációban való hozzáadásával állítjuk le. A fehérjét fenol-kloroformos kirázással távolltjuk el. A DNS-t etanollal kicsapjuk, majd 0,2 mg/ml koncentrációban 65 vízben oldjuk. 24 Sí nukleázzal való további emésztés céljából a DNS-t 30 percig 37 °C-on inkubáljuk 1,5 egység Sí nukleázzal 50 pl, 30 mM nátrium-acélát (pll4,6), 200 mM nátrium-klorid, 1 mM cink-szulfát oldatban. Fenol-kloroformos extrakció után a DNS-L etanollal kicsapjuk, majd újra oldjuk 45 pl 10 mM Tris-HCl (pH8,0) pufferban. k) Az 1,86 kb méretű Bgllll-Ball restrikciós fragment izolálása A BglII restrikciós helyen a fentiek szerint Klenow DNS polimerázzal és Sí nukleázzal tompa végűre alakított 1,86 kb méretű BglII-Ball fragmentet 0,8%-os preparativ agaróz gélen TRIS-borát-EDTA (pII8,3) pufferban elválasztjuk és izoláljuk. A gél-blokkokból a 9Bf példában leírtak szerint elektro-elúcióval nyerjük ki a DNS-t. l) Az 1,86 kb méretű DNS-fragment klónozása megfelelő akceptor DNS-be Az 1,86 kb méretű, tompavégű DNS-fragmentből 0,3 pg-ot (lásd 9Dk példa) 0,6 pg p31RLA-ba (lásd 9Bf példát) ligálunk. A reakciót 20 órán át 15 °C-on folytatjuk 400 egység T4 DNS ligázzal (Biolabs) 10 pl 60 mM TRIS-HC1 (pll7,5), 10 mM magnézium-klorid, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP összetételű pufferban. A ligáló elegyből 3 vagy 6 pl alikvot részeket adunk 100-100 pl kalciummal kezelt, transzformációra kompetens E. coli HB 101 sejthez (lásd 4a. példa) 48 transzformált, ampR telepet növesztünk külön-külön 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban. A plazmid DNS-t Holmes és munkatársai (26) módszerével állítjuk elő, majd EcoRl-gyes emésztéssel analizáljuk. 12 klón tartalmazza a megfelelő orientációban az 1,86 kb méretű DNS-fragmentet. Ezeket a kiónokat a PH05 promoter és a TPA strukturgén kapcsolódási helyét tartalmazó DNS-szakasz nukleotid-sorrendjének meghatározásával tovább elemezzük. Olyan szintetikus oligodezoxinukleotidot használunk, mely a PHU5 promoter mRNS starthelyéhez közel hibridizólódik és lehetővé teszi a nukleotidsorrend meghatározását 3’ irányban. Az M13 reverz priming körülményeket (43) alkalmazzuk a kettősszálú plazmid DNS denaturáláséra és a szintetikus oligodezoxinukleotid hibridizálására. A DNS szekvenálást a leírás (39) szerint végezzük. Két klón tartalmazza a következő, korrekt kapcsolódási helyet:
