201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
39 11U 201115 B 40 r » CGC CGACCG ffGAl CCAGGAACACCCGACTCCTCAAAAGCAAATGAGATCC »CGC CTCTTCTTCTTCA » 4 < GAAGACACTG* CAAAGGí yCGCAGTC CTTCTCT [tGaI TPA transzlációs stop-kodon 1, 2, 3, 4 a linker (5’-CCTCGAGG-3’) helyzete A fenti négy M13 származék [M13mp9/PH05~TPA (Xhol 1-4)] mindegyikéből 2 Mg RF DNS-t izolálunk, BamllI és Xhol enzimekkel emésztjük, és a 2,5 kb méretű fragmentet alacsony olvadáspontú agaróz gélektroforézissel izoláljuk (lásd 5c. példa). Hasonlóképpen 2 Mg p31R (Xhol) DNS-t emésztünk Xhol és IlindlII enzimekkel és a 134 bp méretű fragmentet izoláljuk. A pJD13207 élesztöplazmidból 2 pg-t BamllI és HindlII enzimekkel emésztünk, majd a 6,5 kb méretű fragmentet a fentiek szerint izoláljuk. A három fragmentet 15 °C-on 15 órán át ligáljuk és E. coli HB101 sejteket transzformálunk velük, ampicillin rezisztenciára szelektálunk. A plazmid DNS-t tizenkettesével csoportosított telepekből izoláljuk, és a konstrukciókat HindlII, Xhol, és BamHI restrikciós endonukleázokkal végzett restrikciós elemzéssel vizsgáljuk. A négy klónozó kísérletből származó izolátumokat a kővetkezőképpen jelöljük: pjDB207/PHO5-TPA a 1, pjDB207/PHO5-TPA A 2, pjDB207/PHO5-TPA a 3, pjDB207/PHO5-TPA a 4, 9. Példa A p31RL/TPA (12-2) plazmid készítése (16. ábra) A PH05 promoter és az érett TPA-t kódoló szakasz összekapcsolását szintetikus oligodezoxinukleotiddal végezzük. Az ezt az öligodezoxinukleotid linkért a PU05 promoter 3’ végén tartamazó plazmidot használjuk akceptor DNS-ként az érett TPA-t kódoló szakasz klónozására. A. A p31L akceptor plazmid készítése (16. ábra) a) A p31R plazmid emésztése EcoRI enzimmel és alkalikus foszfatázzal 3 Mg p31 plazmid DNS-t (lásd 6e példa) 6 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal GO percig 37 °C-on emésztünk a szállító (Boehringer) által előírt körülmények között. A teljes megemésztés után a mintát 10 percig 65 °C-on tartjuk, hogy inaktiváljuk az enzi-10 met. 0,05 térfogat 1M Tris-HCl-t (pH8,0) és 2 egység borjúbél alkalikus foszfatázt (Boehringer) adunk hozzá. Az elegyet 60 percig 37 °C-on tartjuk, majd 1 órán a 65 °C-on, hogy a foszfatázt inaktiváljuk. A DNS-t DE52 15 (Whatman) ioncserés kromatográfiával tisztítjuk. A DNS-t a DE52-re (100 pl ágytérfogat szilikonozott Pasteur pipettában) alacsony sótartalmú pufferban (150 mM nátrium-klorid, 10 mM TRIS-HC1, pH8,0 mM EDTA) adszorbeal- 20 juk és nagy sótartalmú puffer-oldattal (1,5 M nátrium-klorid, 10 mM TRIS-HC1, 1 mM EDTA) eluáljuk. A leoldott DNS-t etanollal kicsapjuk és 0,15 mg/ml koncetrációban 10 m Tris-HCl-ben (pH8,01) oldjuk. 25 b) A kémiailag szintetizált DNS linker ligálása az EcoRl-gyel és alkalikus foszfatázzal emésztett p31R plazmidhoz. 30 Az 5 ’-GAATTCCATGGTACCATGGAATTC-3 ’ képletű oligodezoxiriukleotídot a foszfotriészter módszerrel (Ttakura et al (40) de Rooy al (41)] szintetizáljuk. Az oligodezoxinukleotid nukleotid-sorrendje olyan, hogy az egyik fe- 35 le komplementer a másikkal. A kezelés során 24 bázispár méretű, kétBzálú DNS linkért kapunk 5 Mg szitetikus oligodezoxinukleotidot az 5’ végen foszforilezünk 7,5 pCi /t~32p/~ -ATP-vel (5 000 ci/mmól, Amersham) 50 pl 40 60 mM TRISZ-HC1 (pH7,5), 10 mM magnóziura-klorid, 4 mM DTT, 0,5 m ATP és 35 egység T4 polinukleotid kináz összetételű oldatban 30 percig, 37 °C-on. Az elegyet tovább inkubáljuk 5 percig 75 °C-on, hagyjuk szobahő- 45 mérsékletre hűlni, majd -20 °C-on tároljuk. 2,5 pg radioaktív foszorral jelzett öszszetapadt linker DNS-t önmagával lígálunk 50 pl, 60 mM Tris-HCl (pH7,6) 3,5 M ATP, 5 mM DTT összetételű oldatban, 2 000 egység 50 T4 DNS ligázzal (Biolabs), 6 °C-on éjszakán ét inkubálva. A T4 DNS ligázt inaktiváljuk, az elegyet 10 percig 65 °C-on tartva. A kapott multimer linker DNS-t 55 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal emésztjük 60 pl, 55 100 mM TRIS-HC1 (pH7,5), 10 mM magnézium-klorid, 50 mM nátrium-klorid összetételű oldatban, 60 percen át 37 °C-on tartva az elegyet. A reakciót a minta cseppfolyós nitrogénbe helyezésével állítjuk le. 0,5 pg foszfo- 60 rilezett, EcoRI-gyel hasított linker DNS-t 300 egység T4 DNS ligázzal (Biolabs) EcoRI-gyel és alkalikus foszfatázzal emésztett p31 DNS-sel kapcsolunk össze 10 pl, 60 mM TRIS-HCl (pH7,5), 10 mM magnézlum-klorid, 1 mM ATP 65 és 5 mM DTT összetételű pufferban, 3 órás 22
